腺病毒介導(dǎo)的泛素連接酶RNF8敲低能增強(qiáng)膀胱癌對放療的敏感性.pdf

1、目的：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)癌癥中具有第二位致死性的疾病，也是世界上在男性中第六位常見發(fā)病的惡性腫瘤。然而，在膀胱癌的臨床治療中存在一些不容樂觀的現(xiàn)狀，因此需要人們?nèi)ヌ剿鳌l(fā)展治療的新策略。其中腺病毒介導(dǎo)的基因治療在臨床上的應(yīng)用具有顯著提高病人療效的潛在價(jià)值，而且該方法還具備在治療中保留膀胱的可能性。RNF8是一種泛素連接酶，它能促進(jìn)DNA的損傷修復(fù)。RNF8在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，且這種高表達(dá)能由腺病毒介導(dǎo)的shRNA處理而逆轉(zhuǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)

2、的目的是探索經(jīng)由腺病毒介導(dǎo)的shRNA敲低RNF8對膀胱癌的放療效果的獨(dú)特的靶向作用。
　　方法：培養(yǎng)并收獲處于對數(shù)生長期的三種膀胱癌細(xì)胞系T24、BIU87和5637用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)以比較RNF8在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)量，對取自膀胱癌病人的癌組織也通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)比較其RNF8的表達(dá)情況。隨后，應(yīng)用免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)來探測膀胱癌細(xì)胞中內(nèi)源性RNF8的自發(fā)表達(dá)。接下來將膀胱癌細(xì)胞系暴露于2 Gy的X射線輻射中，通過免疫熒光試驗(yàn)來檢測由

3、DNA損傷引起的RNF8和γ-H2AX聚集的電離輻射灶（IRIF）。在膀胱癌細(xì)胞系中運(yùn)用腺病毒介導(dǎo)的shRNA來敲低RNF8的表達(dá)，隨后用這些細(xì)胞進(jìn)行一項(xiàng)克隆形成實(shí)驗(yàn)。用免疫印跡實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證RNF8敲低的效果。對ShRNF8處理的細(xì)胞及其對照施加5 Gy的射線照射或不進(jìn)行照射。通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法對 T24膀胱癌細(xì)胞系進(jìn)行染色，實(shí)行TUNEL實(shí)驗(yàn)，以確定RNF8敲低引起膀胱癌對射線輻射的高敏感性的內(nèi)在作用機(jī)理。進(jìn)一步通過吖啶橙(AO)/碘

4、化丙啶(PI)復(fù)染色法來研究T24膀胱癌細(xì)胞系在shRNF8和電離輻射的雙重處理下的凋亡情況。使用RNF8被敲低或未敲低的T24細(xì)胞來檢驗(yàn)其受到電離輻射后的DNA損傷修復(fù)進(jìn)程，γ-H2AX被用作不同時(shí)間點(diǎn)上的雙鏈斷裂檢測標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)中感染了腺病毒介導(dǎo)的 shRNF8或shNull載體或未使用腺病毒感染的對照細(xì)胞被照射了5 Gy電離輻射。為了調(diào)查RNF8對膀胱癌細(xì)胞中組蛋白 H2A和 H2B的泛素化的作用影響，對被轉(zhuǎn)染了shRNF8或sh

5、Null的T24細(xì)胞進(jìn)行5 Gy電離射線照射，然后使用上述細(xì)胞裂解物做免疫印跡實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步研究RNF8在膀胱癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)中的作用，首先使用shRNA敲低細(xì)胞中RNF8的表達(dá)，隨后應(yīng)用免疫熒光試驗(yàn)來檢驗(yàn)幾種不同的DNA損傷的信號或修復(fù)蛋白，包括MDC1、53BP1、BRCA1和RAP80所形成的由電離輻射引起而聚集的IRIF是否是RNF8依賴的。通過實(shí)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探索RNF8的這種作用是否也會(huì)在動(dòng)物模型中重現(xiàn)。通過對裸

6、鼠皮下注射T24細(xì)胞來建立膀胱癌腫瘤模型。當(dāng)腫瘤明顯形成后，這些裸鼠被隨機(jī)分成shRNF8和 shNull處理組。在腫瘤形成起的第1、3、5天時(shí)共三次分別對兩組裸鼠的膀胱癌腫瘤內(nèi)注射腺病毒載體。在處理的第5天時(shí)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)來評估兩組裸鼠的腫瘤樣品里RNF8的表達(dá)情況。在第6天時(shí)讓這些裸鼠照射電離射線，之后每3天檢測一次腫瘤的生長情況。使用蘇木精/伊紅染色來檢驗(yàn)對種植腫瘤的放射治療的組織學(xué)狀況。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)膀胱癌細(xì)胞系

7、中RNF8的表達(dá)相比于對照組正常的膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC-1有著明顯的上調(diào)（P<0.05）。同時(shí)，在取自接受了根治性膀胱切除術(shù)的膀胱癌患者的癌組織樣品中 RNF8的表達(dá)相比于正常的膀胱癌旁組織也有著明顯的提高（P<0.05）。免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果顯示在膀胱癌細(xì)胞系中RNF8聚集的IRIF和γ-H2AX IRIF發(fā)生了清晰的共定位?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，通過不同劑量的（2 Gy、4 Gy和8 Gy）電離輻射的兩組未經(jīng)腺病毒處理的和經(jīng)s

8、hNull腺病毒處理的膀胱癌細(xì)胞在每種電離輻射的劑量作用下均未表現(xiàn)出明顯的存活差異，然而經(jīng)shRNF8腺病毒處理過的細(xì)胞卻表現(xiàn)出相比于上述對照組存活率下降的現(xiàn)象。綜上所述，說明RNF8下調(diào)能增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對放療的敏感性。未經(jīng)射線照射的膀胱癌細(xì)胞均表現(xiàn)出低水平的凋亡現(xiàn)象。然而在對 T24細(xì)胞照射5Gy電離輻射后，被shRNF8處理過的細(xì)胞顯示出顯著高于對照細(xì)胞的TUNEL陽性率（P<0.01）。AO/ PI復(fù)染試驗(yàn)的結(jié)果也提示被shRNF

9、8處理過的細(xì)胞的凋亡率比對照組高（P<0.001），這和TUNEL試驗(yàn)的結(jié)論保持一致。在電離輻射照射后的早期時(shí)間點(diǎn)（2小時(shí)和4小時(shí)），三組的γ-H2AX IRIF形成的數(shù)量沒有明顯的不同。然而在電離輻射照射后24小時(shí)，在未經(jīng)腺病毒處理的和經(jīng)shNull腺病毒處理的膀胱癌細(xì)胞均展現(xiàn)出大部分的 DNA雙鏈斷裂都已被修復(fù)時(shí)，經(jīng)shRNF8腺病毒處理過的細(xì)胞卻表現(xiàn)出明顯多于上述對照組的γ-H2AXIRIF（P<0.05）。在射線照射后的對照組膀

10、胱癌細(xì)胞中泛素化組蛋白 Ub-H2A和 Ub-H2B的水平增加了，但是在RNF8沉默的細(xì)胞中無論是否照射了電離射線都表現(xiàn)出比shNull處理過的對照組細(xì)胞更低的泛素化組蛋白 Ub-H2A和 Ub-H2B的水平。在RNF8沉默的膀胱癌細(xì)胞中，作用于RNF8上游的γ-H2AX和 MDC1均在放療后形成明顯的 IRIF。然而作用于 RNF8下游的 DNA損傷修復(fù)蛋白53BP1、BRCA1和 RAP80均難以在DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)聚集和維持存留。

11、相比于shNull處理的對照組， RNF8的表達(dá)在 shRNF8處理的實(shí)驗(yàn)組中有所下降。盡管在shRNF8處理的實(shí)驗(yàn)組和shNull處理的對照組中裸鼠的體型和重量沒有明顯的區(qū)別，但是在shRNF8處理的實(shí)驗(yàn)組中膀胱癌腫瘤的生長比shNull處理的對照組有著顯著的減少。shRNF8處理的實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織顯示出比shNull處理的對照組更多的細(xì)胞壞死和凋亡。
　　結(jié)論：泛素連接酶RNF8在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，腺病毒介導(dǎo)的shRNF8可

12、明顯下調(diào)RNF8表達(dá)。RNF8能促進(jìn)DNA損傷應(yīng)答，而RNF8參與了放療后膀胱癌細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)暗示了RNF8可能成為膀胱癌治療的新靶點(diǎn)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中由實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存的減少證實(shí)了 RNF8敲低能夠使膀胱癌細(xì)胞對放療的敏感性增強(qiáng)。其內(nèi)在作用機(jī)制是，RNF8沉默會(huì)引起膀胱癌細(xì)胞在放療后的高凋亡率以及雙鏈斷裂修復(fù)信號通路受損。這說明了對膀胱癌細(xì)胞聯(lián)合施加shRNF8和電離輻射的處理能通過在RNF8敲低的情況下引發(fā)凋亡和使雙鏈斷