膀胱癌特異性的嵌合型溶瘤腺病毒構(gòu)建及其療效初步評價.pdf

1、目的：對于惡性度高的膀胱癌細(xì)胞，其表面的柯薩奇-腺病毒受體（CAR）表達(dá)極低，5型腺病毒有限的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率難以發(fā)揮溶瘤效果。我們課題組通過基因改造變換病毒的親嗜性，即選用11型腺病毒纖毛結(jié)合5型腺病毒骨架，并將膀胱組織特異性啟動子尿路空斑蛋白2（UPII）和前列腺干細(xì)胞抗原增強(qiáng)子（PSCAE)的基序插入病毒復(fù)制早期基因E1A前，構(gòu)建具有膀胱癌選擇性的不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A。觀察嵌合型腺病

2、毒對EJ和T24兩種膀胱癌細(xì)胞株的形態(tài)、增殖能力的影響，探求病毒的最適感染劑量，進(jìn)一步對比觀察嵌合型腺病毒 Ad/F11-PSCAE-UPII-E1A和5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A對EJ和T24細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和溶瘤能力的差異，為膀胱癌基因治療提供新的選擇和實驗依據(jù)。
　　方法：將嵌合11型纖毛的5型腺病毒骨架Ad5/F11，與本室保存的穿梭質(zhì)粒Rp-PSACE-UPII-E1A，在大腸桿菌BJ5183內(nèi)將同源區(qū)段替

3、換重組。在卡那霉素抗性條件下，篩選出陽性單克隆重組子菌落，抽提質(zhì)粒后PCR擴(kuò)增UPII、PSCAE和E1A基因，并用PacI和BsrGI酶切質(zhì)粒，電泳檢測產(chǎn)物大小。挑取鑒定完全正確的重組腺病毒質(zhì)粒，純化后設(shè)不同比例轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察病毒包裝結(jié)果。提取第一代腺病毒基因組，經(jīng) PCR檢測各目的基因的正確性，然后以第一代病毒感染HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增，純化病毒后采用TCID50法測定滴度。常規(guī)培養(yǎng)EJ和T24細(xì)胞，以HEK293為標(biāo)

4、準(zhǔn)，RT-PCR檢測兩種細(xì)胞表面CD46的相對表達(dá)量。CCK8測定嵌合型腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A在不同梯度的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）下，對EJ細(xì)胞和T24細(xì)胞的溶瘤能力，取病毒感染最佳MOI，與5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A作比較，病毒干預(yù)8d后，測定EJ和T24兩種細(xì)胞的活力變化。
　　結(jié)果：腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A

5、構(gòu)建成功，滴度為1×1010PFU/ml。RT-PCR數(shù)據(jù)顯示EJ和T24細(xì)胞的CD46表達(dá)明顯高于HEK293細(xì)胞。CCK8測定結(jié)果表明，以20～40 MOI病毒量干預(yù)EJ和T24細(xì)胞后，細(xì)胞存活率的下降速度最快。與Ad5-PSCAE-UPII-E1A相比，Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A對EJ和T24細(xì)胞的溶瘤作用較為顯著。感染8d后，Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A病毒干預(yù)組 EJ和 T24細(xì)胞的存活率分別

6、為19.6±3.48％和51.8±2.48%；Ad5-PSCAE-UPII-E1A病毒干預(yù)組EJ和T24細(xì)胞的存活率分別為33.38±2.54%和80.27±2.18%。
　　結(jié)論：膀胱選擇性的高滴度腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A構(gòu)建成功，能高效殺傷T24和EJ細(xì)胞，溶瘤能力優(yōu)于腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A，這與病毒識別受體的改變有關(guān)，提示增加病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可直接強(qiáng)化病毒溶瘤效果，這為膀胱癌治療的