分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑應(yīng)用于耐藥結(jié)核病治療的探索性研究.pdf

1、目的：
　　結(jié)核病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，耐藥結(jié)核防治形勢(shì)尤為嚴(yán)峻。分枝桿菌噬菌體能裂解結(jié)核分枝桿菌，具有潛在藥用價(jià)值。本研究旨在通過(guò)對(duì)分枝桿菌噬菌體生物學(xué)特性、基因組學(xué)和血清學(xué)的研究篩選分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑的配方噬菌體。體外觀察噬菌體雞尾酒制劑殺滅結(jié)核分枝桿菌的能力以及恥垢分枝桿菌對(duì)雞尾酒制劑的耐藥突變頻率，評(píng)價(jià)噬菌體雞尾酒制劑的安全性，探討其抗耐藥結(jié)核病治療的潛力。
　　方法：
　　1.對(duì)噬菌體的形態(tài)、MOI、增殖周

2、期和寬噬率等生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究，從分枝桿菌噬菌體D29、33D、TM4、Legendre、DNAIII、BO4、Leo、Clark和Sedeg中初步篩選出裂解能力強(qiáng)、裂解譜廣的噬菌體，作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法配方噬菌體的備選項(xiàng)。
　　2.鳥(niǎo)槍法對(duì)初步篩選出的噬菌體進(jìn)行全基因組測(cè)序，生物信息學(xué)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)及初步的基因注釋，以排除溶原性噬菌體和含有致病基因的噬菌體。
　　3.中和實(shí)驗(yàn)和交叉中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定雞尾酒療法配方噬菌體

3、的吸附常數(shù)和交叉吸附常數(shù)以確定噬菌體自身的抗原性及噬菌體之間是否存在交叉吸附表位；通過(guò)體外殺菌(恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌)實(shí)驗(yàn)，比較噬菌體雞尾酒療法與D29體外殺菌能力；終點(diǎn)滴定反濁法測(cè)定恥垢分枝桿菌對(duì)雞尾酒制劑配方噬菌體的耐藥突變頻率；改構(gòu)噬菌體的劑型，將改構(gòu)劑型與裸噬菌體分別對(duì)豚鼠滴鼻給藥，比較在不同時(shí)間點(diǎn)到達(dá)豚鼠肺部的噬菌體數(shù)量及其存活情況。
　　4.根據(jù)藥典行過(guò)敏檢查和熱源檢查，評(píng)估噬菌體雞尾酒制劑的安全性；巨噬細(xì)胞吞噬

4、噬菌體實(shí)驗(yàn)，觀察噬菌體被巨噬細(xì)胞清除的過(guò)程；噬菌體雞尾酒制劑滴鼻實(shí)驗(yàn)，觀察給藥期間小鼠活動(dòng)情況和體重的變化，于給藥8周后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，觀察臟器肉眼病變程度，同時(shí)行臟器病理組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　1.噬菌體D29噬菌斑圓形透明，直徑5 nm；D29尾長(zhǎng)129 nm；最佳MOI為10-4；D29感染宿主菌的潛伏期約為50 min，裂解量為10；D29能裂解所有受測(cè)結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體33D噬菌斑圓形透明，直徑2

5、 nm；33D尾長(zhǎng)201 nm；最佳MOI為10-5；33D感染宿主菌的潛伏期約為150 min，裂解量為24；33D能裂解95.65％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體TM4噬菌斑圓形透明，直徑1.5nm；TM4尾長(zhǎng)177 nm；最佳MOI為10-4；TM4感染宿主菌的潛伏期約為150 min，裂解量為28；TM4能裂解91.30％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Legendre噬菌斑圓形透明，直徑1 nm；Legendre尾長(zhǎng)215

6、nm；最佳MOI為10-4；Legendre感染宿主菌的潛伏期約為180 min，裂解量為13；Legendre能裂解91.30％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體DNAIII噬菌斑渾濁，邊界模糊；DNAIII尾長(zhǎng)208 nm；最佳MOI為10-4；DNAIII感染宿主菌的潛伏期約為165 min，裂解量為28；DNAIII能裂解78.26％結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體BO4噬菌斑圓形透明，直徑1 nm；BO4尾長(zhǎng)215 nm；最佳MO

7、I為10-4；BO4感染宿主菌的潛伏期約為120 min，裂解量為37；BO4能裂解86.96％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Leo噬菌斑圓形透明，直徑1.5 nm；Leo尾長(zhǎng)211 nm；最佳MOI為10-5；Leo感染宿主菌的潛伏期約為150 min，裂解量為74；Leo能裂解86.96％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Clark噬菌斑圓形渾濁，邊界模糊；Clark尾長(zhǎng)227 nm；最佳MOI為10-4；Clark感染宿主菌的潛伏

8、期約為150min，裂解量為26；Clark能裂解82.61％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Sedeg噬菌斑圓形渾濁，邊界模糊；Sedeg尾長(zhǎng)233 nm；最佳MOI為10-4；Sedeg感染宿主菌的潛伏期約為120 min，裂解量為39；Sedeg能裂解52.17％的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥株。根據(jù)噬菌體基本生物學(xué)特性初步篩選出噬菌體D29、33D、TM4和Legendre作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法的候選噬菌體。
　　2.采用鳥(niǎo)

9、槍隨機(jī)測(cè)序法對(duì)噬菌體33D測(cè)序，組裝出一條長(zhǎng)50036bp的線性雙鏈DNA序列。采用glimmer在線分析軟件分析，確定33D有84個(gè)推定基因。對(duì)這些基因進(jìn)行逐個(gè)BLAST同源檢索分析，得到17個(gè)已知功能的基因。gene6、gene7、gene8、gene9和gene14為噬菌體DNA復(fù)制相關(guān)基因；gene28(WhiB)為調(diào)節(jié)基因；gene47(Lysin B)和gene48(Lysin A)為裂解酶基因；gene57、Gene59、

10、gene60、gene61、gene64、gene70、gene74、gene75和gene76為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因。生物信息學(xué)分析確定噬菌體33D為裂解性噬菌體，33D噬菌體基因組無(wú)致病基因。
　　采用鳥(niǎo)槍隨機(jī)測(cè)序法對(duì)噬菌體Legendre測(cè)序，組裝出一條長(zhǎng)40733 bp的線性雙鏈DNA序列。采用glimmer在線分析軟件分析，確定Legendre有58個(gè)推定基因。對(duì)這些基因進(jìn)行逐個(gè)BLAST同源檢索分析，得到19個(gè)已知功能的基

11、因。gene25 RDF、gene26(Repressor)和gene27(Integrase)編碼與噬菌體溶源化相關(guān)的整合酶-阻遏蛋白系統(tǒng)；gene31(Lysin B)和gene32(Lysin A)為裂解酶基因；gene39、gene41、gene42、gene43、gene44、gene45、gene46、gene52、gene53、gene56和gene57為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因。Legendre的gene26阻遏蛋白與噬菌體BP

12、s、angle和Halo的編碼阻遏蛋白的gene33完全一致，Legendre與噬菌體BPs、angle和Halo一樣屬于溶原性噬菌體，不能入選雞尾酒療法。
　　3.噬菌體D29、33D和TM4對(duì)溫度、紫外線、酸堿和酒精均敏感。與pH7.4的固體培養(yǎng)基比較培養(yǎng)基pH5時(shí)不會(huì)影響D29裂解宿主菌；雖然在pH5的環(huán)境中33D裂解宿主菌的能力嚴(yán)重受損，但是依然有部分噬菌體能裂解宿主菌；TM4在pH5培養(yǎng)基中不能侵染宿主菌形成噬菌斑。

13、r>　　D29的K值為1070；33D的K值為704；TM4的K值為234。噬菌體D29、33D和TM4，TM4的抗原性最低。噬菌體D29、33D和TM4之間不存在交叉吸附表位，通過(guò)不同途徑感染宿主。
　　噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)抑制恥垢分枝桿菌的能力明顯強(qiáng)于單一噬菌體D29(P<0.05)；噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)殺滅和抑制耐藥結(jié)核分枝桿菌的能力明顯強(qiáng)于單一噬菌體D29(P<0.05)。

14、>　　恥垢分枝桿菌對(duì)噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)的耐藥突變率為10-8明顯低于對(duì)單一噬菌體D29的耐藥突變率10-6。
　　利用恥垢分枝桿菌mc2155無(wú)毒株作為保護(hù)載體(保護(hù)劑組)，觀察發(fā)現(xiàn)給藥后1 h和4 h保護(hù)劑組的噬菌體在小鼠氣管和肺部的滴度均明顯高于裸噬菌體組(P<0.05)。表明在豚鼠體內(nèi)恥垢分枝桿菌對(duì)噬菌體有顯著的保護(hù)作用。
　　4.過(guò)敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第14天激發(fā)后粗制噬菌體組有兩只豚鼠均出現(xiàn)不同程度

15、的過(guò)敏現(xiàn)象；純化噬菌體組豚鼠在第14天和第21天激發(fā)后均未出現(xiàn)任何過(guò)敏現(xiàn)象。熱原檢查實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新西蘭白兔在注射供試品(純化噬菌體D29、33D和TM4)后體溫?zé)o明顯變化。
　　通過(guò)熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)噬菌體與巨噬細(xì)胞作用10 min后被巨噬細(xì)胞吞噬，作用15 min后巨噬細(xì)胞內(nèi)形成少量噬菌體-吞噬溶酶體，作用20 min后形成大量噬菌體-吞噬溶酶體，作用48 h噬菌體完全被巨噬細(xì)胞清除。
　　分別采用噬

16、菌體雞尾酒制劑(50μL/200μL)或生理鹽水(50μL/200μL)滴鼻后，各組小鼠進(jìn)食量、活動(dòng)量基本正常。在暴露8周后，各組動(dòng)物的體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。給藥8周后，解剖小鼠，肉眼觀察各組動(dòng)物的臟器，肺臟、脾臟、肝臟均未見(jiàn)明顯異常；在顯微鏡下觀察肺臟、肝臟、脾臟的組織病理切片，均未見(jiàn)明顯異常。
　　結(jié)論：
　　分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)具有比單一噬菌體(D29)更強(qiáng)的殺滅耐藥結(jié)核分枝桿菌