我國臨床和環(huán)境煙曲霉對唑類藥物耐藥的流行病學(xué)研究.pdf

1、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是一類在自然環(huán)境中廣泛存在的機(jī)會性致病真菌，主要通過無性產(chǎn)孢形式快速播散，可導(dǎo)致人和動物出現(xiàn)多種慢性和急性曲霉病，其中以侵襲性肺曲霉?。↖nvasive pulmonary aspergillosis，IPA）病情最為嚴(yán)重，病死率常達(dá)50％以上。近年來，由于惡性腫瘤、血液干細(xì)胞移植等易感人群增加，IPA發(fā)病率呈上升趨勢，而煙曲霉則成為導(dǎo)致住院患者死亡的一類主要感染性病原體。唑類藥物是臨

2、床治療曲霉病最主要的一線藥物，然而自1997年首次報(bào)道出現(xiàn)對伊曲康唑耐藥的煙曲霉以后，臨床和環(huán)境分離的煙曲霉對唑類藥物耐藥的報(bào)道不斷增加，部分國家醫(yī)療機(jī)構(gòu)唑類耐藥煙曲霉的檢出率高達(dá)10%，導(dǎo)致曲霉病的臨床治療變得更加困難。煙曲霉對唑類藥物耐藥最常見的耐藥機(jī)制是羊毛甾醇14α-去甲基化酶的編碼基因cyp51A出現(xiàn)點(diǎn)突變，其上游啟動子區(qū)域可能同時出現(xiàn)一定長度的串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeat，TR），包括TR34/L98H和TR46

3、/Y121F/T289A等，農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑的廣泛使用被認(rèn)為是導(dǎo)致這類突變株出現(xiàn)和流行的最主要原因。由于目前我國臨床機(jī)構(gòu)曲霉病診斷率低、微生物實(shí)驗(yàn)室不常規(guī)開展煙曲霉的藥敏實(shí)驗(yàn)、農(nóng)業(yè)殺菌劑使用與真菌耐藥性產(chǎn)生之間的關(guān)聯(lián)研究缺乏，導(dǎo)致我國臨床和環(huán)境煙曲霉對唑類藥物耐藥的流行現(xiàn)狀和產(chǎn)生機(jī)制仍不清楚。
　　本研究的主要目的是：
　?。?）通過在我國多個地區(qū)開展臨床和環(huán)境煙曲霉耐藥性監(jiān)測，獲得煙曲霉對臨床唑類藥物耐藥的流行情況與主要耐藥

4、機(jī)制；
　　（2）通過對煙曲霉進(jìn)行分子分型和全基因組測序分析，揭示國內(nèi)外唑類藥物耐藥與敏感煙曲霉的遺傳變異特征與進(jìn)化關(guān)系；
　?。?）通過對植物致病真菌與煙曲霉耐藥特征進(jìn)行比對分析以及開展唑類殺菌劑耐藥表型檢測和體外耐藥誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，揭示農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑使用對煙曲霉耐藥性產(chǎn)生的可能影響。
　　2014-2015年間，與位于我國不同地區(qū)的11家醫(yī)院合作開展臨床煙曲霉監(jiān)測，經(jīng)分離鑒定獲得臨床煙曲霉317株；從北京、上海等13個城

5、市的醫(yī)院、市內(nèi)公園或農(nóng)田采集392份環(huán)境標(biāo)本，經(jīng)真菌培養(yǎng)和鑒定獲得環(huán)境煙曲霉144株。利用含有伊曲康唑或伏立康唑的1640培養(yǎng)平板對所有煙曲霉進(jìn)行耐藥性篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有10株煙曲霉可以同時在含有伊曲康唑和伏立康唑的培養(yǎng)基生長，這些菌株進(jìn)一步被鑒定為唑類藥物耐藥株（伊曲康唑或伏立康唑MIC值≥4mg/L），包括8株臨床株和2株環(huán)境株。臨床和環(huán)境煙曲霉總體耐藥率分別為2.5%（8/317）和1.4%（2/144）。這些耐藥菌株來自福州、上

6、海、成都、北京和沈陽等5個城市。進(jìn)一步對cyp51A基因突變進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株臨床株攜帶TR34/L98H突變，2株臨床株和2株環(huán)境株出現(xiàn)TR34/L98H/S297T/F495I突變，這些菌株均對伊曲康唑高度耐藥（MIC值≥16 mg/L）。另外，我們首次在國內(nèi)檢出1株含有TR46/Y121F/T289A突變的對伏立康唑高度耐藥（MIC值≥16 mg/L）的煙曲霉，該菌株分離自某醫(yī)院患者痰液標(biāo)本。該患者高度疑似出現(xiàn)IPA，既往沒有

7、使用唑類藥物的歷史，在感染發(fā)生約2周后死亡。在153株隨機(jī)選取的唑類藥物敏感煙曲霉中，36株（23.5%）至少含有1個位點(diǎn)的突變，以N248K突變最為常見。A9T、M172V/A330P和N248K/M499K突變僅在環(huán)境株檢出，而D343N、I242V、K314T、D262Y、F46Y/M172V/E427K等突變僅在臨床株檢出。另從1株來自上海的臨床株和1株來自新疆的環(huán)境株中檢出一種既往報(bào)道可能與耐藥相關(guān)的F46Y/M172V/N2

8、48T/D255E/E427K突變。
　　進(jìn)一步對10株唑類耐藥株和153株唑類敏感株進(jìn)行CSP、STR分型和Mating型別檢測。CSP分型結(jié)果顯示，5株TR34/L98H突變株和4株TR34/L98H/S297T/F495I分別屬于t02和t04A型，而TR46/Y121F/T289A屬于t01型。92株臨床株共分為15個CSP型別，61株環(huán)境株共分為7個CSP型別，其中以t01、t04A和t03型最常見。Mating型別檢測

9、結(jié)果顯示，4株TR34/L98H/S297T/F495I突變煙曲霉屬于MAT1-2型，而其他6株耐藥株為MAT1-1型。153株敏感株中MAT1-1和MAT1-2型菌株分別有87株（56.9%）和66株（43.1%）。對我國163株唑類耐藥和敏感煙曲霉進(jìn)行 STR分型分析結(jié)果顯示，臨床和環(huán)境煙曲霉均呈散在分布，8株唑類耐藥株屬于一個大的聚類分枝，這個簇群占所有被調(diào)查菌株的49.1%。來自成都的1株TR34/L98H突變型煙曲霉與其他煙曲

10、霉遺傳距離較遠(yuǎn)，而TR46/Y121F/T289A突變型煙曲霉則屬于另一個主要由敏感環(huán)境株構(gòu)成的聚類分枝。整理獲得文獻(xiàn)報(bào)道的836株煙曲霉STR分型信息，結(jié)合本研究163株煙曲霉分型結(jié)果進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)大部分TR34/L98H突變株和TR46/Y121F/T289A突變株分布在其中一個主要克隆簇群，來自印度的許多TR34/L98H突變株具有相同的STR型別，提示存在克隆播散的可能。本研究分離的TR46/Y121F/T289A突變株與來

11、自荷蘭臨床或環(huán)境標(biāo)本的相同突變煙曲霉具有較近的遺傳背景。我國分離的TR34/L98H/S297T/F495I突變性煙曲霉與其他各類唑類藥物耐藥株之間的STR分型差異較大。利用Illumina公司的Miseq600測序儀，對本研究收集的18株煙曲霉進(jìn)行全基因組測序，與荷蘭、英國和印度等3個國家的基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，構(gòu)建基于SNP的煙曲霉進(jìn)化樹，結(jié)果顯示本研究鑒定的5株TR34/L98H突變株中有4株與荷蘭、英國和印度等3個國家的耐

12、藥突變株共同被分入一個大的進(jìn)化枝，而本研究鑒定的4株TR34/L98H/S297T/F495I突變株與這個主要進(jìn)化枝SNP差異較大，可能與TR34/L98H主要克隆株具有不同的進(jìn)化來源。
　　通過對唑類殺真菌劑使用和植物致病真菌耐藥特征進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研分析，以及對煙曲霉與植物致病真菌甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)許多常使用的農(nóng)業(yè)三唑類殺真菌劑與臨床三唑類藥物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而唑類耐藥相關(guān)的煙曲霉cy

13、p51A基因Y121、Y431、G432、G448和F495等位點(diǎn)突變，與文獻(xiàn)報(bào)道的植物病原真菌耐藥突變位點(diǎn)存在對應(yīng)關(guān)系。TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I和TR46/Y121F/T289A等3種耐藥突變煙曲霉均表現(xiàn)出對農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑（如氟環(huán)唑、糠菌唑、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑等）的交叉耐藥性，而TR34/L98H/S297T/F495I突變株對抑霉唑和咪鮮胺這2種農(nóng)業(yè)咪唑類殺菌劑的MIC值高于TR34/L98H突

14、變株和唑類敏感株（P<0.01）。對22株煙曲霉的體外耐藥誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，伊曲康唑可誘導(dǎo)出P216L、G54V等突變的耐藥株，而氟環(huán)唑、戊唑醇、抑霉唑等也可使敏感煙曲霉轉(zhuǎn)變?yōu)榉哼蝾愃幬锬退幹辍?br>　　本研究提示，TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I等環(huán)境介導(dǎo)的耐藥機(jī)制是我國煙曲霉對唑類藥物耐藥的主要機(jī)制，TR46/Y121F/T289A突變型煙曲霉已在我國臨床出現(xiàn)，并可能與患者的不良結(jié)局有關(guān)；我國TR34/L

15、98H/S297T/F495I突變株與國內(nèi)外其他具有相同或類似突變的耐藥株具有不同的基因型，而且遺傳背景差異較大，可能具有不同的進(jìn)化來源；TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I等突變株均表現(xiàn)出對農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑的交叉耐藥性，其中TR34/L98H/S297T/F495I突變株對咪唑類殺菌劑具有更高的耐藥性；體外藥物篩選壓力作用下，農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑可誘導(dǎo)出泛唑類藥物耐藥煙曲霉菌株，提示農(nóng)業(yè)殺菌劑的廣泛使用可能是我國煙曲

16、霉耐藥性產(chǎn)生的重要原因。
　　與既往研究相比，本研究最主要的創(chuàng)新性在于：
　　（1）國內(nèi)首次在多地區(qū)開展臨床和環(huán)境煙曲霉唑類耐藥性調(diào)查研究；
　　（2）國內(nèi)外首次綜合利用多種分子分型技術(shù)和全基因組測序技術(shù)進(jìn)行唑類耐藥株遺傳變異和溯源進(jìn)化分析研究；
　　（3）創(chuàng)新性地從農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑的使用情況、耐藥機(jī)制比較及其在體外實(shí)驗(yàn)條件下導(dǎo)致煙曲霉發(fā)生耐藥突變的功能驗(yàn)證等多方面，揭示農(nóng)業(yè)唑類殺菌劑使用與煙曲霉耐藥性產(chǎn)生之間的關(guān)