鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥機制和分子流行病學研究.pdf

1、近年來非發(fā)酵菌在臨床分離的致病菌中呈增長趨勢，其中最重要的菌種是不動桿菌和銅綠假單孢菌，不動桿菌中又以鮑曼不動桿菌最常見。不動桿菌為條件致病菌，廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和人體的皮膚表面。目前，鮑曼不動桿菌已成為繼銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌之后的重要臨床分離致病菌。 目前不動桿菌的基因分型方法有很多種，包括核酸分型、脈沖場凝膠電泳、隨機擴增多態(tài)性DNA、擴增片段長度多態(tài)性分析。其中脈沖場凝膠電泳（PFGE）是分型方式中的“金

2、標準”，目前已不僅僅是研究手段，還作為臨床菌株常規(guī)流行病學工具，發(fā)展了同種細菌的分型工具。 本研究對南方醫(yī)院05年至08年臨床收集的醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復(fù)合體的菌株進行研究，首先用多重PCR技術(shù)快速鑒定出鮑曼不動桿菌菌株，然后從外排泵、外膜蛋白、碳青霉烯類酶幾個方面探索其耐藥機制，并對其進行分子流行病學分析和研究；所涉及的統(tǒng)計學分析和處理采用SPSS 13．0軟件。 第一部分、多重PCR方法進行鮑曼不動桿菌的快速鑒定研究

3、。 目的：鮑曼不動桿菌是院內(nèi)感染的重要致病因素，快速鑒定有利于及時治療感染和預(yù)防暴發(fā)流行．本研究建立多重PCR實驗技術(shù)快速鑒定鮑曼不動桿菌，同時為之后的實驗做準備。 方法：本研究建立了多重PCR實驗技術(shù)，設(shè)計一對特異性引物直接鑒定鮑曼不動桿菌，同時設(shè)計的另一對不動桿菌的通用引物亦可以鑒定不動桿菌菌屬；2對引物放入一個反應(yīng)體系中進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 結(jié)果：多重PCR分析南方醫(yī)院臨床分離的17

4、0株鮑曼不動桿菌及鮑曼-醋酸鈣不動桿菌的結(jié)果表明，整個過程所需時間約2小時左右。每一株菌株都擴增出對應(yīng)于recA基因的分子量大小約為425bp的片段序列，即能確定是屬于不動桿菌屬；其中138株擴增出片段大小約為208bp對應(yīng)于16sRNA基因的間隔區(qū)域（ITS）的片段序列，可確認為鮑曼不動桿菌，32株未擴增出此序列的則應(yīng)該是醋酸不動-鮑曼不動桿菌復(fù)合體中其他不動桿菌。 同時行陰性對照菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單

5、孢菌等11只菌株的多重PCR實驗，結(jié)果顯示未擴增出任何一個目的片段，均為陰性結(jié)果。無擴增產(chǎn)物。 結(jié)論：本實驗結(jié)果表明，多重PCR技術(shù)可以較好地對鮑曼不動桿菌進行鑒別，并能在2小時左右完成試驗，該技術(shù)為鮑曼不動桿菌的快速鑒定提供了又一可供選擇的手段，今后可以拓展對臨床菌株的快速鑒定，有利于及時有效的治療和院感控制暴發(fā)流行。 第二部分、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌外排泵adeABC研究。 目的：外排泵系統(tǒng)是革蘭氏陰性桿菌

6、耐藥的重要機制之一，而在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制中是否起作用尚存在分歧。本研究從外排泵表型和基因型兩個方面論證外排泵系統(tǒng)在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中所起的作用。 方法： 1．本研究通過主動外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙（CCCP）對138株鮑曼不動桿菌的外排泵進行了檢測，主動外排泵表型檢測的陽性標準是加主動外排泵抑制劑后美洛培南的最小抑菌濃度降低至少四倍以上； 2．選取61株鮑曼不動桿菌菌

7、株，用熒光定量PCR測定了外排泵adeABC在61株菌中的表達情況。明晰外排泵在對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中是否起作用；外排泵adeABC在該類抗生素的耐藥機制中是否起作用。統(tǒng)計學分析分別采用卡方檢驗和t檢驗，p<0．05有統(tǒng)計學差異。 結(jié)果： 1．泵抑制劑羰基氰氯苯腙（CCCP）和美羅培南協(xié)同實驗的結(jié)果顯示：使用CCCP之后，138株臨床分離菌中，CCCP抑制實驗共篩選出泵陽性菌株28株，其中對美羅培南耐藥的39株菌

8、中有15株即38．4%的菌株的MIC降低了4倍或以上，為泵陽性株；對美羅培南敏感的99株菌中有13株即13．1%的菌株的MIC降低了4倍或以上，為泵陽性株。經(jīng)卡方檢驗統(tǒng)計學分析，差異有顯著意義。（x2=12．477b，P=0．01）； 2．熒光定量PCR檢測菌株的AdeB和16s rRNA后，根據(jù)檢測結(jié)果計算出各標本的AdeB和16s rRNA的拷貝數(shù)，然后計算出表達量差異。經(jīng)t檢驗統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示碳青霉烯類抗生素敏感組的Ad

9、eB的表達量是0．8991±1．17239，耐藥組的表達量是21．1010±21．44315，敏感組的表達量顯著低于耐藥組的表達量，差異有統(tǒng)計學意義。（t=4．403，P=0．000） 結(jié)論：提示主動外排泵機制在南方醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中起作用。AdeB基因或者AdeABC外排泵機制可能在南方醫(yī)院臨床菌株對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中起作用。 第三部分、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌外膜蛋白C

10、arO機制研究。 目的：本研究在基因表達和蛋白表達兩個水平上檢測鮑曼不動桿菌的外膜蛋白CarO在耐藥菌和敏感菌中表達量的差別，以明晰外膜蛋白CarO是否參與鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的機制。 方法：基因表達水平用熒光定量PCR技術(shù)對外膜蛋白carO基因進行表達量的檢測；蛋白表達水平的研究通過先制備和純化膜蛋白CarO的多克隆抗體，再利用western bloting技術(shù)對臨床收集的菌株進行外膜蛋白CarO的檢測，

11、蛋白表達量用灰度值計算。統(tǒng)計學分析采用t檢驗。 結(jié)果： 1．根據(jù)熒光定量PCR的檢測結(jié)果計算出各標本的carO和16s rRNA的拷貝數(shù)，然后計算出表達量差異。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示碳青霉烯類抗生素敏感組的carO的表達量為0．39±0．612，耐藥菌的carO的表達量為2．98±3．463，敏感菌carO的基因表達量顯著低于耐藥組carO的表達量，差異有顯著的統(tǒng)計學意義； 2．成功制備外膜蛋白CarO的多克隆抗體；

12、western blot結(jié)果顯示用灰度值比較敏感菌和耐藥菌外膜蛋白CarO表達量，t檢驗結(jié)果顯示敏感菌外膜蛋白CarO表達量為717．515±395．84，耐藥菌外膜蛋白CarO表達量為255．1033±23．26767，統(tǒng)計學分析有顯著差異。（t=2．857，P=0．001） 結(jié)論：carO基因水平表達敏感菌表達量比耐藥菌表達量低，而蛋白水平表達CarO敏感菌表達量比耐藥菌表達量則高?？赡艿牟聹y是是否外界環(huán)境或其他因素比如藥物

13、作用對耐藥菌的菌體產(chǎn)生了某種影響，使細菌的轉(zhuǎn)錄水平RNA不能正常地進入翻譯的步驟進行正常的翻譯，從而形成堆積。而敏感菌則由于外界環(huán)境未受影響，轉(zhuǎn)錄水平RNA可以正常地進入翻譯狀態(tài)。 第四部分、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶OXA研究。 目的：本研究嘗試使用多重聚合酶鏈反應(yīng)即多重PCR的實驗技術(shù)，將所收集的96株鮑曼不動桿菌菌株進行OXA基因的檢測，區(qū)分鑒定編碼碳青霉烯類酶的四個OXA亞群的等位基因，從而研究各OXA類

14、碳青霉烯類酶在臨床菌株的分布狀況。 方法：通過設(shè)計OXA個亞群基因的多對引物，放入一個PCR反應(yīng)體系中進行聚合酶鏈擴增反應(yīng)。 結(jié)果：本實驗研究顯示96株鮑曼不動桿菌中，只攜有OXA-51的耐藥菌有9株，敏感菌有33株；同時攜有OXA-51和OXA-58兩個基因的耐藥菌株有38株，敏感菌株有6株；同時攜有OXA-51和OXA-23的耐藥菌和敏感菌各1株；8株菌未擴增出OXA基因；未有單純攜帶OXA23和OXA58的菌株。

15、 結(jié)論：本研究結(jié)果顯示在近三年南方醫(yī)院的臨床菌株中，耐藥機制中OXA-51協(xié)同OXA-58起主要作用；與以往國內(nèi)的相關(guān)研究結(jié)果有比較大的差異，可能的原因是區(qū)域和收集菌株時間的不同造成了攜帶OXA基因的差異。 第五部分、南方醫(yī)院鮑曼不動桿菌脈沖場凝膠電泳分析。 目的：本研究以南方醫(yī)院05年-08年臨床分離的鮑曼不動桿菌為研究對象，進行脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析，分析近三年南方醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌的基因分型和

16、分布情況，為鮑曼不動桿菌的分子流行病學研究和流行病學暴發(fā)流行控制提供基礎(chǔ)。 方法：采用脈沖場凝膠電泳對臨床分離的138株鮑曼不動桿菌進行分子流行病學研究，確認這些菌株的親緣關(guān)系，并對臨床暴發(fā)流行分析。PFGE條帶判定結(jié)果的解釋：通過目測判定其帶型之間的關(guān)系，按照以下原則：（1）大多數(shù)流行病學相關(guān)帶型大小和數(shù)量相近的菌株被認為是同一菌株（主流型），稱為A型（2）由于突變、插入、缺失或倒置的基因改變在帶型上有與主要表型有1-3個差別

17、的菌株被認為是主要型中的亞型，分別稱為A1、A2、A3；（3）帶型上有4或4個以上的不同之處，不能用1次或2次基因變化來解釋的，被認為是不同的菌株，分別稱為B、C、D。 結(jié)果：根據(jù)脈沖場凝膠電泳分析，138株鮑曼不動桿菌中有87株屬于同一菌株（主流型），本文將之稱為A克隆，時間跨度上從05年的菌株到08年的菌株都有該型；并且分布在不同的科室之間；其中條帶完全相同的有45株菌，條帶差異1-3條的有A1-A3克隆株有42株菌；B克隆