密碼子優(yōu)化的蛋白酶K在畢赤酵母中的表達(dá)及分離純化.pdf

1、蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)分泌的一種重要的絲氨酸蛋白酶，具有較高的蛋白水解活性。蛋白酶K多用于一些生化實驗中，如在核酸提取中，可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶;在原位雜交中，蛋白酶K具有降解包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，可以用來處理雜交前的樣本，提高檢測的敏感性。現(xiàn)在商業(yè)化供應(yīng)的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌獲得。林伯氏白色念球菌生長緩慢，難以高密度培養(yǎng)，蛋白酶K的產(chǎn)量較低。另外

2、，林伯氏白色念球菌還會分泌其他的蛋白酶，增加了下游分離純化的難度。本實驗利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)了蛋白酶K的分泌表達(dá)，省去了細(xì)胞破碎，DNA沉淀等步驟，提高了產(chǎn)物的回收率。
　　為了提高蛋白酶K的表達(dá)量及簡化分離純化工藝，本實驗對蛋白酶K密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，將蛋白酶K的密碼子都變成了畢赤酵母偏愛的密碼子，并在目的基因3'端加上六個組氨酸標(biāo)簽，然后利用人工合成的方法獲得目的基因。實驗構(gòu)建了蛋白酶K酵母表達(dá)載體，將其導(dǎo)入畢赤酵母GS1

3、15中實現(xiàn)了分泌表達(dá)，分泌的蛋白酶K可以利用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行分離純化，減少了分離純化步驟，提高了蛋白酶K的收率。由于發(fā)酵條件對產(chǎn)物的表達(dá)量有很大影響，實驗對誘導(dǎo)溫度、pH、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時間等條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件。利用優(yōu)化的條件進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，并通過測定了菌體生長曲線來確定開始誘導(dǎo)時間。在下游分離純化中，利用三種方法進(jìn)行純化，通過比較這三種純化方法的酶收率及比活，確定最佳的純化方法。
　　結(jié)果表明，pP

4、IC9K-proteinase K表達(dá)載體構(gòu)建正確，并實現(xiàn)了在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。通過搖瓶發(fā)酵確定的最佳發(fā)酵條件為甲醇量0.75％，溫度25℃，pH7.0，誘導(dǎo)時間為144h。利用優(yōu)化的條件進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，蛋白酶K表達(dá)量可以達(dá)到2.2 g/L，比目前現(xiàn)有蛋白酶K工業(yè)生產(chǎn)方法的產(chǎn)率（0.3-0.5 g/L發(fā)酵液）高4-7倍。最后，通過比較三種純化方法的酶收率及比活，可以看出，將去菌體后的發(fā)酵液直接通過Ni-NTA親和層析柱層析可以得