巨峰葡萄VvCHS4、VvHSP101及VvCBF3基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、研究葡萄花色素苷生物合成代謝調(diào)控及抗高溫、低溫的分子機(jī)制,從分子水平揭示葡萄花色素苷合成及其相關(guān)基因的表達(dá)模式以及抗高溫、低溫的機(jī)制,這對(duì)于利用基因工程改良葡萄著色及抗高溫低溫能力有著非常重要的意義,將為今后培育著色好、具有較好的抗高低溫能力的葡萄新品種提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究從歐美雜種葡萄巨峰(Vitis vinifera×V.Labrusca‘Kyoho’)中克隆了VvCHS4、VvCHI、VvHSP101及VvCBF3基

2、因,并采用半定量RT-PCR技術(shù),以actin基因?yàn)閮?nèi)參,對(duì)VvCHS4、VvCHI及VvHSP101基因在巨峰葡萄果實(shí)不同發(fā)育階段的果皮、果肉、種子和高溫處理下的一年生扦插苗中的表達(dá)進(jìn)行了分析,同時(shí)分析了去袋對(duì)VvCHS4和VvCHI基因在套袋巨峰果實(shí)中表達(dá)的影響.
　　 1、同源克隆獲得了VvCHS4基因的cDNA全長(zhǎng)；對(duì)其序列分析表明:VvCHS4基因含有一個(gè)內(nèi)含子,兩個(gè)外顯子,cDNA全長(zhǎng)1182bp；與VvCHS1、V

3、vCHS2、VvCHS3基因在核苷酸水平上的同源性分別為99.3％、92.6％和76.02％；VvCHS4基因編碼的蛋白質(zhì)既沒(méi)信號(hào)肽,也沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu),且定位于細(xì)胞質(zhì)中,同時(shí)也預(yù)測(cè)了CHS4蛋白的三維模型。與葡萄基因組比對(duì)結(jié)果表明,VvCHS4基因在葡萄基因組中有3個(gè)拷貝,其中2個(gè)定位于第14條染色體上,另1個(gè)未定位。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明,VvCHS4基因在果皮、果肉、種子及葉片和根系中都表達(dá),在花后30d的果皮中表達(dá)強(qiáng)烈,隨后

4、迅速降低,到花后70d表達(dá)又增強(qiáng)；VvCHS4基因在花后30-45d的果肉中表達(dá)較高,隨后迅速減低；在花后45d的種子中也表達(dá)強(qiáng)烈,隨著果實(shí)發(fā)育,其表達(dá)逐漸下降；套袋果實(shí)去袋當(dāng)天VvCHS4基因在果皮中的表達(dá)較強(qiáng)。高溫處理抑制VvCHS4基因在盆栽一年生巨峰葡萄幼葉中的表達(dá),并誘導(dǎo)VvCHS4基因在幼根的表達(dá)。
　　 2、同源克隆獲得了VvCHI基因的cDNA全長(zhǎng)；對(duì)其序列分析表明:VvCHI基因序列中含有3個(gè)內(nèi)含子,4個(gè)外顯子

5、；cDNA全長(zhǎng)705bp；生物信息學(xué)分析表明,VvCHI基因編碼的多肽鏈既沒(méi)有信號(hào)肽,也不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,而且亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中,并預(yù)測(cè)了CHI蛋白的三維模型。與葡萄基因組比對(duì)結(jié)果表明,VvCHI基因在葡萄基因組中有2個(gè)拷貝,定位于第13條染色體上。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明,VvCHI基因在果皮,果肉、種子、幼葉及幼根中都表達(dá),但不同的組織中表達(dá)方式不同。VvCHI基因在花后30和90d的果皮中強(qiáng)烈表達(dá)；但在果肉中,VvCHI基

6、因在花后90d表達(dá)強(qiáng)烈,而在種子中于花后45d表達(dá)強(qiáng)烈,隨果實(shí)發(fā)育,其表達(dá)逐漸下降。套袋果實(shí)去袋當(dāng)天在果皮中表達(dá)強(qiáng)烈,但在種子中表達(dá)較弱。高溫處理抑制VvCHI基因在一年生盆栽巨峰葡萄幼葉中的表達(dá),但隨處理時(shí)間延長(zhǎng),其表達(dá)又有所恢復(fù)；高溫誘導(dǎo)VvCHI基因在幼根的表達(dá)。
　　 3,同源克隆獲得了VvHSP101基因的cDNA全長(zhǎng)；對(duì)其序列分析表明:巨峰葡萄VvHSP101基因cDNA序列全長(zhǎng)2736bp；與歐洲葡萄VvHSP10

7、1基因(AAX08108.1,XP002284179.1)在核苷酸水平上的同源性為99％,與煙草HSP101基因(AAC83688.2)的同源性為89％；巨峰葡萄HSP101蛋白含有P-loopNTPase結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合位點(diǎn)等,在其序列中既沒(méi)有信號(hào)肽也沒(méi)跨膜結(jié)構(gòu),是親水性蛋白,并預(yù)測(cè)了巨峰葡萄HSP101蛋白的三維模型。與葡萄基因組比對(duì)結(jié)果表明,VvHSP101基因在葡萄基因中只有1個(gè)拷貝,定位于第17條染色體上,含有5個(gè)內(nèi)含子。半

8、定量RT-PCR分析結(jié)果表明,巨峰葡萄VvHSP101基因主要在種子和果皮中表達(dá),在果肉中不表達(dá),花后60d的種子中表達(dá)最強(qiáng)。高溫處理誘導(dǎo)巨峰葡萄VvHSP101基因在幼葉中表達(dá)。
　　 4、同源克隆獲得了VvCBF3基因的cDNA全長(zhǎng),對(duì)其序列分析結(jié)果表明,巨峰葡萄VvCHBF3基因cDNA全長(zhǎng)720bp；與中國(guó)山葡萄(Vitis amurensis)CBF3(ACD45468；ABF61219)在核苷酸水平上的同源性為98％

9、；與河岸葡萄(Vitis riparia)CBF(AAR28675)的同源性為95％；與歐洲葡萄CBF(XP002267961)的同源性為94％；與山葡萄CBF1(ABU55656)的同源性為69％。巨峰葡萄VvCBF3基因氨基酸序列中具有AP2結(jié)合域,在AP2結(jié)合域的上游和下游具有極類似于RPAGRxKFxETRHP和DSAWR的序列,但蛋白質(zhì)序列中沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)；通過(guò)SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)了三維模型。與葡萄基因組比