變異鏈球菌中抗壞血酸特異性磷酸轉移酶系統(tǒng)相關基因的初步研究.pdf

1、目的：
　　鑒于ptxA基因在S.mutans抗壞血酸代謝中發(fā)揮的重要作用，為了探究ptxA基因上游的ptxB基因是否也發(fā)揮著類似的作用，并明確它們之間的關系，本研究擬構建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因雙重缺陷菌株，及其功能補償菌株，研究上述缺陷菌株和補償菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產酸、耐酸、合成胞外多糖及形成生物膜的能力，明確ptxA、ptxB基因對S.mutans生物學特性的影響。此外，對ptxA、pt

2、xB基因及其鄰近基因的轉錄情況進行分析，以加深對S.mutans抗壞血酸特異性PTS的理解。
　　第一章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能補償菌株的構建
　　目的:
　　構建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因雙重缺陷菌株，并另外構建ptxA功能補償菌株、ptxB功能補償菌株和ptxA、ptxB功能補償菌株，為后續(xù)研究奠定基礎。
　　方法:
　　根據S.mutans UA159全基因

3、組的序列，采用Primer Premier5.0軟件設計目的基因的上下游引物，并PCR擴增上下游片段。以pFW5質粒為載體，通過雙酶切，將上下游片段插入至質粒的兩個多克隆位點中，構建目的基因缺陷的重組質粒。而后，在感受態(tài)刺激肽的作用下，將此重組質粒轉化入野生型S.mutansUA159中，構建基因缺陷菌株。利用類似方法，以pDL278質粒為載體，構建功能補償質粒，而后轉化入相應的基因缺陷菌株中，構建功能補償菌株。
　　結果:

4、>　　經過PCR鑒定和測序鑒定，ptxB缺陷菌株（ptxB-）、ptxAB雙重基因缺陷菌株（ptxAB-）、ptxA功能補償菌株（CptxA-）、ptxB功能補償菌株（CptxB-）和ptxAB功能補償菌株（CptxAB-）構建成功。
　　第二章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因對其生物學特性的影響
　　目的:
　　研究S.mutans UA159、ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptxA-菌株、C

5、ptxB-菌株、CptxAB-菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力，明確ptxA、ptxB基因對S.mutans生物學特性的影響。
　　方法:
　　1.配制抗壞血酸特異性培養(yǎng)基。采用胰蛋白胨-維生素培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，添加濃度為15 mmol/L的抗壞血酸，以提供S.mutans生長所需的碳源。
　　2.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長情況。將S.mutans UA15

6、9、ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptxA-菌株、CptxB-菌株、CptxAB-菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h。期間每隔2h測量各菌液的OD600值，繪制各菌株的生長曲線。
　　3.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的產酸能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中作為實驗組，對照組加入至BHI培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)前、培養(yǎng)24 h后及培養(yǎng)48 h后分別測

7、量各培養(yǎng)基的pH值，計算各菌株培養(yǎng)前后的△pH值。
　　4.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的耐酸能力。將7種菌株置于抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)至OD600≈0.3，離心，收集菌胞，加入至pH5.0的抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，37℃厭氧孵育1h進行酸適應。而后，采用0.1mol/L，pH7.0的甘氨酸溶液洗滌，0.1 mol/L，pH2.8的甘氨酸溶液重懸，并靜置0，15，30，45 min，對細菌進行酸沖擊。隨后，將

8、菌液進行梯度稀釋，涂板，37℃厭氧培養(yǎng)48h后觀察平板上的菌落數。
　　5.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生物膜形成能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，并轉移至已放置好無菌蓋玻片的六孔板中，37℃厭氧培養(yǎng)120 h。經過洗滌、干燥，使用SYTO9對細菌形成的生物膜進行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，隨機選擇5個視野進行拍照。使用Image J軟件對所有照片進行分析，計算生物膜平均的覆蓋面積。
　　6.探究各菌

9、株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的胞外多糖合成能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，并轉移至已放置好無菌蓋玻片的六孔板中，37℃厭氧培養(yǎng)120 h。經過洗滌、干燥，使用Calcofluor White對細菌合成的胞外多糖進行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察。
　　結果:
　　1.與野生型S.mutans UA159相比，缺陷株的生長能力受到明顯影響。ptxA缺陷菌株的遲緩期延長，其終末菌密度降低。ptxB缺陷菌株與ptxAB

10、雙重基因缺陷菌株在監(jiān)測的72 h內未見明顯增長。ptxA功能補償菌株和ptxAB功能補償菌株可在一定程度上補償缺陷菌株的生長能力，但仍未達到野生株的水平。而ptxB功能補償菌株無法對缺陷菌株的生長能力進行補償。
　　2.野生株、缺陷株和補償株在BHI培養(yǎng)基中的產酸能力相同，而在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中不同。培養(yǎng)24 h后，野生株UA159培養(yǎng)基的pH值輕微下降，而三種缺陷菌株培養(yǎng)基的pH值基本不變，與野生株相比，△pH的差異均具有統(tǒng)

11、計學意義(P＜0.05)。ptxA、ptxAB功能補償菌株可在一定程度上補償缺陷菌株的產酸能力，但ptxB功能補償菌株卻無法對此進行補償。在培養(yǎng)48 h后，各菌株培養(yǎng)基的pH值進一步下降，且野生株和缺陷株在產酸能力上的差異更加明顯，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　3.經過1 h pH5.0的酸適應和15 min pH2.8的酸沖擊后，三種缺陷菌均無法在瓊脂平板上長出。
　　4.經SYTO9染色的細菌生物膜呈現綠色。野生

12、株UA159形成的生物膜較為致密，細菌團塊較大，遍布整個視野，覆蓋面積為65.93％。ptxA基因缺陷菌株所形成的生物膜較野生型稀疏，呈網狀結構，存在不規(guī)則圓形或橢圓形大小不一的孔隙，覆蓋面積僅為39.61％。ptxB、ptxAB基因缺陷菌株無法形成具有三維結構的生物膜，細菌呈短鏈狀排列，散在分布，覆蓋面積分別為24.24％和18.57％。ptxA、ptxAB功能補償菌株形成的生物膜與野生株相似，但孔隙較大，而ptxB功能補償菌株無法恢

13、復至野生株的水平。
　　5.經Calcofluor White染色的細菌胞外多糖呈現藍色。各菌株合成胞外多糖的情況與其形成生物膜的情況類似，胞外多糖的分布與生物膜的分布基本一致。ptxA、ptxB、ptxAB基因缺陷菌株所合成的胞外多糖較野生株明顯減少。
　　結論:
　　1.S.mutans的ptxA、ptxB基因與抗壞血酸的轉運代謝密切相關。
　　2.ptxA、ptxB基因的缺陷可影響S.mutans在抗壞血酸

14、特異性培養(yǎng)基中的生長、產酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力。
　　第三章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因及其鄰近基因轉錄情況的研究
　　目的:
　　分析S.mutans中ptxA、ptxB基因及其鄰近的sgaT、SMU.273、SMU.274、SMU.275基因的轉錄情況，探究在S.mutans中是否存在與抗壞血酸轉運代謝相關的操縱子。
　　方法:
　　1.對ptxA、ptxB基因及其鄰近基因進行PC

15、R分析。提取S.mutans的基因組DNA及總RNA，將其逆轉錄為cDNA。根據S.mutans的全基因組序列，跨越SMU.268與sgaT(a)，sgaT與ptxB(b)，ptxB與ptxA(c)，ptxA與SMU.273(d)，SMU.273與SMU.274(e)，SMU.274與SMU.275(f)，SMU.275與SMU.277(g)設計引物，實驗組以cDNA為模版，陽性對照組以基因組DNA為模版進行PCR反應，反應產物進行瓊脂

16、糖凝膠電泳，觀察實驗組是否出現與陽性對照組大小一致的條帶。
　　2.qRT-PCR檢測抗壞血酸對S.mutans中ptxA、ptxB基因及其鄰近基因表達的影響。將野生型S.mutans分別置于抗壞血酸或葡萄糖特異性培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)至對數生長后期，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，以16S rRNA為內參，使用qRT-PCR檢測抗壞血酸對ptxA、ptxB基因及其鄰近基因表達的影響。
　　3.使用qRT-PCR檢測野生型S.m

17、utans及ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的表達情況。
　　4.統(tǒng)計學分析。采用SPSS20.0軟件對qRT-PCR的結果進行統(tǒng)計學分析。采用兩獨立樣本t檢驗的方法，P＜0.05代表具有統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　　1.瓊脂糖凝膠電泳顯示，b、c、d、e、f的實驗組在與陽性對照組一致的位置上出現了條帶，而a和g的實驗組未出現條帶。
　　2.在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，S.mutans UA159菌株的sgaT，

18、ptxB，ptxA，SMU.273，SMU.274，SMU.275基因的mRNA表達量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.與野生型S.mutans相比，ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的mRNA相對表達量值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結論:
　　1.S.mutans的ptxA，ptxB基因與其上游的sgaT基因，及其下游的SMU.273，SMU.274，SMU.275基因