三種肺炎鏈球菌表面蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)的特異性IgG抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù).pdf

1、在所有可通過(guò)疫苗預(yù)防的疾病中，肺炎鏈球菌疾病是導(dǎo)致全球5歲以下兒童死亡的首要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球每年約有160萬(wàn)人死于各種肺炎鏈球菌疾病，其中5歲以下兒童占100萬(wàn)，90％以上的死亡病例在發(fā)展中國(guó)家。肺炎鏈球菌抗生素耐藥形勢(shì)也日趨嚴(yán)峻。因此，世界衛(wèi)生組織推薦將肺炎鏈球菌疫苗納入各國(guó)家/地區(qū)的免疫規(guī)劃項(xiàng)目中。
　　 方法：本研究利用基因重組技術(shù)、重組蛋白原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建，制備了肺炎鏈球菌Lpl蛋白以及第146位氨基酸缺失的

2、溶血素（Ply）。通過(guò)體外溶血試驗(yàn)鑒定Ply蛋白及其突變體△A146 P1y蛋白的溶血活性；通過(guò)中和試驗(yàn)和肺組織切片分析明確△A146 Ply特異性抗體的中和毒素能力和免疫原性。采用Western技術(shù)分析Ply蛋白和Lpl蛋白在不同菌株中的表達(dá)情況以獲得保守性信息。疫苗候選ClpP、Lpl、△A146 Ply蛋白單一或聯(lián)合免疫小鼠，利用鼻腔攻毒方式評(píng)價(jià)其減少細(xì)菌肺內(nèi)定植的能力；利用腹腔攻毒實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)肺炎鏈球菌引起的嚴(yán)重感染敗血癥的抵抗

3、能力。利用抗體吸附試驗(yàn)將產(chǎn)生的特異性抗體消除，并模擬被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)分析特異抗體在保護(hù)中的作用。
　　 結(jié)果：本研究成功制備△A146 Ply重組蛋白，其溶血活性全部喪失?！鰽146 Ply蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的多克隆抗體能有效抑制野生Ply的溶血活性。經(jīng)Western分析，Lpl和Ply在本研究所采用的12株不同血清型肺炎鏈球菌中均有表達(dá)。候選分子單一保護(hù)效果試驗(yàn)顯示：Lpl、△A146 Ply、ClpP蛋白免疫后，均能使肺炎鏈球菌血清型

4、19F和14的肺內(nèi)定植減少10倍以上（P<0.05）；使用強(qiáng)毒力的肺炎鏈球D39（血清型2型）腹腔攻毒，△A146 Ply和ClpP組小鼠的中位生存期延長(zhǎng)。在使用D39菌株鼻腔攻毒時(shí)，ClpP和Lpl蛋白幾乎沒(méi)有保護(hù)效果；而△A146 Ply蛋白單一使用的保護(hù)效率為50％，與聯(lián)合Lpl和（或）ClpP保護(hù)效力相當(dāng)。后續(xù)試驗(yàn)中，我們重點(diǎn)評(píng)價(jià)了三種蛋白聯(lián)合使用（IC247）的有效率，使用致死劑量的14、19F、23F鼻腔攻毒，IC247有效

5、率均為100％；對(duì)于致死劑量的血清型6B鼻腔攻毒，有效率為80％；而對(duì)于由4種不同血清型所致的混合感染，IC247的有效率為70％。IC247所提供的保護(hù)效果與目前市場(chǎng)上使用的23價(jià)多糖疫苗和7價(jià)蛋白結(jié)合疫苗效果相當(dāng)。Lpl、ClpP、△A146 P1y蛋白特異性IgG抗體缺失的IC247抗血清在被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中不能提供保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：三種表面蛋白具有一定的協(xié)同保護(hù)效果，IC247候選疫苗組合能有效抵抗多種血清型肺炎鏈球菌