嗜熱鏈球菌耐酸機(jī)制的初步研究.pdf

1、嗜熱鏈球菌作為酸奶的發(fā)酵劑在后酸化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，本論文旨在對(duì)嗜熱鏈球菌的耐酸機(jī)制進(jìn)行初步研究，為嗜熱鏈球菌耐酸機(jī)制的闡明奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為酸奶后發(fā)酵的控制提供了理論指導(dǎo)。
　　通過(guò)對(duì)嗜熱鏈球菌在不同乳糖含量的IRIE培養(yǎng)基中培養(yǎng)，明確了嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)特征。對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的嗜熱鏈球菌進(jìn)行酸刺激處理1h，采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)比刺激前后蛋白種類與表達(dá)量的變化，結(jié)果為培養(yǎng)到對(duì)數(shù)初期(4 h)的蛋白點(diǎn)為665個(gè)，酸刺激后

2、(5 h)的蛋白點(diǎn)為677，其中有12個(gè)蛋白點(diǎn)在5h樣品中存在而在4h樣品中不存在。提取5h的表達(dá)量相對(duì)于4h的表達(dá)量多于1.5倍以上的70個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)其在酸性環(huán)境中的功能大致分為以下幾類:與金屬離子壓力相關(guān)的蛋白4種，與逆境下修復(fù)保護(hù)機(jī)制相關(guān)的蛋白5種，與代謝途徑相關(guān)的一些酶和亞基27種，與ATP合成酶蛋白，轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的蛋白11種，與氨基酸代謝相關(guān)的酶蛋白8種，其他功能蛋白10種。挑選其中四個(gè)蛋白Alpha-aceto

3、lactatedecarboxylase、UreaseG、UreaseE和60 KD進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證其在轉(zhuǎn)錄組水平上的表達(dá)量變化，結(jié)果5h樣品相對(duì)于4h樣品表達(dá)量分別為15.24倍、13.27倍、8.40倍和0.60倍，蛋白Alpha-acetolactate decarboxylase、UreaseG和UreaseE在轉(zhuǎn)錄組水平上與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致，而蛋白60 KD卻呈現(xiàn)不一致的變化。
　　CiaH

4、是一種可能的耐酸性相關(guān)基因，本研究成功構(gòu)建了該基因的敲除載體，并進(jìn)行了初步的敲除實(shí)驗(yàn)。根據(jù)CiaH上、下游基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為641 bp和698 bp的上下游同源臂，并利用酶切、連接將其插入到pMD18-T中;PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因，通過(guò)酶切、連接后將其插入到重組pMD18-T載體中的上下游片段之間，成功構(gòu)建基因敲除載體。將敲除載體線性化以后轉(zhuǎn)入嗜熱鏈球菌，在氯霉素抗性平板上篩選基因敲除突變株，經(jīng)過(guò)多次篩選未能獲得基因敲除