Ⅱ型豬鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選及初步鑒定.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種常見的革蘭氏陽(yáng)性條件致病菌，可以引起仔豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎及人的腦膜炎等。其中血清Ⅱ型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype2，SS2）流行最廣，致病性最強(qiáng)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也給公共衛(wèi)生和食品安全帶來威脅，成為當(dāng)前人畜共患病新的病原菌。致病菌在宿主體內(nèi)、體外生存的環(huán)境有很大不同，部分毒力因子在細(xì)菌侵染的特殊階段表達(dá)，并

2、受宿主環(huán)境的調(diào)節(jié)，這些基因?qū)儆隗w內(nèi)環(huán)境特異性表達(dá)的體內(nèi)誘導(dǎo)基因（in vivo-induced gene，ivi gene）。體內(nèi)誘導(dǎo)基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后起著至關(guān)重要的作用，也是誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的主要物質(zhì)。因此，確定體內(nèi)誘導(dǎo)基因類群是疾病的診斷和治療的基礎(chǔ)。本文基于抗生素篩選策略應(yīng)用體內(nèi)表達(dá)技術(shù)（in vivo expression technology，IVET），以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol

3、acetyltransferase,cat）基因作為報(bào)告基因，通過氯霉素篩選鑒定Ⅱ型豬鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因。研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)部分：
　　1、構(gòu)建Ⅱ型豬鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因表達(dá)文庫(kù)。采用自殺載體pGP704為骨架，以不帶啟動(dòng)子的cat作為報(bào)告基因克隆到自殺載體pGP704上，構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pGP704-cat；將Ⅱ型豬鏈球菌基因組DNA的500～1000bp酶切片段，克隆到報(bào)告質(zhì)粒pGP704-cat中cat基因的上游，轉(zhuǎn)化受體菌獲得

4、融合基因文庫(kù)；將文庫(kù)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化Ⅱ型豬鏈球菌，得到融合基因表達(dá)文庫(kù)。結(jié)果表明：構(gòu)建的融合基因表達(dá)文庫(kù)以氯霉素作為選擇標(biāo)記，經(jīng)體外培養(yǎng)，獲得2％的菌株具有氯霉素抗性，融合基因表達(dá)文庫(kù)存在可以啟動(dòng)cat基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列，cat基因在體外可以表達(dá)。構(gòu)建的融合基因表達(dá)文庫(kù)可以用于Ⅱ型豬鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選。
　　2、篩選、鑒定Ⅱ型豬鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因。用Ⅱ型豬鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因表達(dá)文庫(kù)經(jīng)腹腔感染乳兔，用氯霉素篩選體內(nèi)表達(dá)基因，再經(jīng)過

5、體外篩選后獲得20株菌。這些菌株都是重組自殺質(zhì)粒pGP704-X-cat整合到Ⅱ型豬鏈球菌染色體上后形成的。提取這些菌株的染色體DNA，經(jīng)SalI酶切，將整合到染色體上的重組自殺質(zhì)粒片段切下，連接片段的兩端形成自身環(huán)化的質(zhì)粒。對(duì)插入片段測(cè)序，得到8個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因片段，經(jīng)BLAST同源性分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)為已知基因，分別編碼：戊糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶、谷氨酸5-激酶、天冬氨酸/酪氨酸/芳香族轉(zhuǎn)氨酶、O-乙酰絲氨酸裂解酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、核酸外切