Ag85A DNA疫苗激活RNA傳感器及其誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).pdf

1、目的:
　　自Wolff等發(fā)現(xiàn)裸DNA經(jīng)肌肉注射可在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并引入DNA疫苗概念以來，人們對(duì)DNA疫苗進(jìn)行了廣泛研究，取得了令人矚目的進(jìn)展。在以往廣泛進(jìn)行的DNA疫苗構(gòu)建、接種后免疫應(yīng)答（固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答）或耐受，及效應(yīng)產(chǎn)物作用機(jī)制研究基礎(chǔ)上，雖然DNA疫苗已用于某些動(dòng)物疾病的治療，但在人類尚缺乏有效性應(yīng)用。限制DNA疫苗在臨床應(yīng)用的主要問題是低免疫原性，接種后不能獲得強(qiáng)有力的保護(hù)性免疫應(yīng)答。為進(jìn)一步探討新的抗原提呈機(jī)

2、制(RNA Sensors and Adaptors)，單一使用既轉(zhuǎn)錄mRNA又翻譯Ag85A蛋白分子的Ag85ADNA質(zhì)粒疫苗，尚不能證明疫苗DNA是否能通過RNA傳感器從抗原提呈細(xì)胞(DC2.4)直接將抗原信息提呈給Th細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。為此，本文進(jìn)行了下面幾方面的工作:
　　1:設(shè)計(jì)Ag85A突變體Ag85A-M（編碼基因114位、230位堿基C突變?yōu)閴A基G，分別形成TAG和TGA雙重翻譯終止子），以期望Ag85A既

3、表達(dá)mRNA，又能編碼抗原蛋白;突變體Ag85A-M只表達(dá)mRNA，不編碼蛋白。
　　2:編碼Ag85A基因突變體的人工合成，合成Ag85A DNA(891bp)全長(zhǎng)抗原蛋白編碼片段和突變體片段，并把片段克隆到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP上。
　　3:構(gòu)建基因組中ROSA26位點(diǎn)敲進(jìn)Ag85A（M)基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)DC2.4細(xì)胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A。
　　4:考察突變體Ag85A-

4、M和Ag85A在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中是否激活RNA傳感器，是否存在一條RNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法:
　　1:用DNAMAN8.0軟件（美國(guó)Lynnon Biosoft公司開發(fā)的高度集成化的分子生物學(xué)綜合應(yīng)用軟件，可以用于多序列比對(duì)、PCR引物設(shè)計(jì)、限制性酶切分析、質(zhì)粒繪圖、蛋白質(zhì)分析等，幾乎囊括了所有日常核酸、蛋白質(zhì)序列的分析工作。）對(duì)Ag85A及突變體Ag85A-M的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行穩(wěn)

5、定性（二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能）分析。
　　2:利用普通PCR法進(jìn)行人工基因合成，通過把Ag85A(mutant，M)全DNA序列分別拆分成A(332bp)、B(332bp)、C(264bp)三個(gè)小片段和D(488bp)、E(423bp)兩個(gè)小片段進(jìn)行分段延伸、單段PCR擴(kuò)增、單段插入片段制作、單段克隆、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、檢菌、質(zhì)粒提取、測(cè)序、PCR擴(kuò)增單段基因及PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。并把全長(zhǎng)片段通過pIRES2-EGFP載體多克隆位點(diǎn)(multip

6、le clone site，MCS)中雙酶切位點(diǎn)EcoRⅠ/BamHⅠ插入載體，構(gòu)建pIRES2-EGFP-Ag85A和pIRES2-EGFP-Ag85A-M載體，進(jìn)行雙酶切和基因測(cè)序，構(gòu)建pET28a-Ag85A和pET28a-Ag85A-M載體，進(jìn)行抗原蛋白原核表達(dá)。
　　3:采用CRISPR/Cas9技術(shù)ROSA26位點(diǎn)Ag85A突變基因敲進(jìn)DC2.4細(xì)胞系的建立，通過共轉(zhuǎn)染具有高活性sgRNA(small guide RN

7、A)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒及含有目的基因的打靶載體pTg2.0-Ag85A(M)到DC2.4細(xì)胞系中，利用嘌呤霉素(puromycin，Puro)進(jìn)行藥物篩選，通過PCR方法篩選鑒定陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。
　　4:通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green qPCR)相對(duì)定量突變體Ag85A-M及Ag85A、RNA傳感器RIG-Ⅰ和Mda-5（Ifih）及適配子MAVS、IRF3、IRF7和IFNβ的mRNA表達(dá)量(Fold c

8、hange)，通過蛋白免疫印跡（Western Blot）電泳探討了Ag85A及突變體抗原蛋白、RNA傳感器及適配子的蛋白表達(dá)情況，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面因子MHCⅡ的活化程度(M2mean)。
　　結(jié)果:
　　1:編碼Ag85A基因突變體的設(shè)計(jì)，原始序列全序列mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能△G=-418.30kcal/mol;突變體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能△G=-416.92kcal/mol，升高了3.3‰，為1.38kcal/mo

9、l，自由能變化很小，保持了Ag85A mRNA原二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。114位點(diǎn)堿基C突變?yōu)镚（TAC→TAG），原始序列局域mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，TAC在圓形環(huán)上;突變序列TAG也在圓形環(huán)上，局域mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和一級(jí)序列都沒有變化（除了TAC中的C變成了G）。230位點(diǎn)堿基C突變?yōu)镚（TCA→TGA），原始序列TCA局域mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在雙鏈與七個(gè)堿基小環(huán)交接處;突變序列TGA在雙鏈與六個(gè)堿基小環(huán)交接處，雖然堿基發(fā)生了變化，但局域mRNA二

10、級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大。
　　2:編碼Ag85A基因突變體的人工合成，從A、B、C和D、E小片段克隆形成的菌落中分別隨機(jī)挑取8個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和測(cè)序，A、B、C陽(yáng)性克隆率平均值為88％，基因保真度為90％;D、E陽(yáng)性克隆率平均值為82％，基因保真度為23％。
　　獲得Ag85A DNA全長(zhǎng)片段和突變體片段。獲得pIRES2-EGFP-Ag85A和pIRES2-EGFP-Ag85A-M表達(dá)載體，酶切檢測(cè)和基因測(cè)序完全正確。pET28

11、a-Ag85A表達(dá)出抗原蛋白，而pET28a-Ag85A-M不表達(dá)抗原蛋白，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。
　　3:采用CRISPR/Cas9技術(shù)ROSA26位點(diǎn)Ag85A突變基因敲進(jìn)DC2.4細(xì)胞系的建立，獲得目的基因序列和插入位點(diǎn)都正確的穩(wěn)轉(zhuǎn)DC2.4-Ag85A(M)細(xì)胞株。
　　4:Ag85A突變體激活RNA傳感器及適配子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，突變體Ag85A-M和Ag85A mRNA表達(dá)量與空細(xì)胞DC2.4(NC)相比具有顯著性升高（P

12、＜0.0001），Ag85A-M和Ag85A之間沒有顯著性差異(P＞0.05);Ag85A表達(dá)抗原蛋白，而突變體Ag85A-M不表達(dá)蛋白。RIG-ⅠmRNA表達(dá)水平在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中與空細(xì)胞相比顯著性升高（P＜0.0001），但DC-Ag85A RIG-ⅠmRNA表達(dá)量也顯著性（P＜0.0001）高于DC-Ag85A-M;RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)量都增加，DC-Ag85A增加的多一些。Mda-5mRNA在DC

13、-Ag85A-M和DC-Ag85A中表達(dá)量都顯著性升高（P＜0.0001），DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中Mda-5mRNA表達(dá)量也呈顯著性差異(P＜0.001);Mda-5蛋白量較空細(xì)胞都有所增加。MAVS也類似，但mRNA表達(dá)量在兩個(gè)細(xì)胞系中無顯著性差異。IRF3與Mda-5情況類似。IRF7情況與MAVS類似。IFNβmRNA兩者都顯著性增加（P＜0.0001），DC-Ag85A-M增加的多一些，DC-Ag85A-M與D

14、C-Ag85A差異不具顯著性（P＞0.05）;特異性蛋白表達(dá)都增加。細(xì)胞表面分子MHCⅡ表達(dá)量較空細(xì)胞都增加，并且具有顯著性(P＜0.0001)。
　　結(jié)論:
　　1:成功自行設(shè)計(jì)和構(gòu)建了Ag85A基因突變體Ag85A-M，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了該突變體只轉(zhuǎn)錄mRNA，不表達(dá)蛋白分子。此突變體中突變區(qū)域均不是雙鏈結(jié)構(gòu)，不會(huì)影響Ag85A mRNA對(duì)RNA傳感器RIG-Ⅰ的活化。
　　2:本文自行設(shè)計(jì)采用Ag85A基因（全長(zhǎng)8

15、91bp）的332bp、332bp和264bp三個(gè)片段拆分策略，利用普通PCR技術(shù)進(jìn)行人工基因合成，可顯著降低堿基錯(cuò)誤率。
　　3:采用最新CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)于ROSA26位點(diǎn)成功敲進(jìn)Ag85A基因突變體至DC2.4細(xì)胞系，經(jīng)PCR技術(shù)鑒定獲得了理想的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
　　4:Ag85A突變體和Ag85A基因敲進(jìn)的DC2.4細(xì)胞系內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA均致RIG-Ⅰ和MDA-5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈顯著性升高，

16、提示Ag85A突變體和Ag85A基因轉(zhuǎn)錄的mRNA誘導(dǎo)了二種RNA傳感器的活化。
　　5:Ag85A突變體和Ag85A基因敲進(jìn)的DC2.4細(xì)胞系內(nèi)MAVS、IRF3和IRF7的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈顯著性升高，提示Ag85A突變體和Ag85A基因轉(zhuǎn)錄的mRNA刺激RIG-Ⅰ和MDA-5活化后，很可能是通過與MAVS、IRF3和IRF7相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，傳出Ag85A突變體基因的免疫原性信號(hào)。為此，我們認(rèn)為Ag85A突變體基因敲進(jìn)

17、的DC2.4細(xì)胞系內(nèi)，其編碼的免疫原性傳出信號(hào)通路是:dsRNA(Ag85A mRNA)→RIG-Ⅰ/MDA-5→MAVS→IRF3/IRF7→IFNβ。
　　6:Ag85A突變體和Ag85A基因敲進(jìn)的DC2.4細(xì)胞表面MHCⅡ與空細(xì)胞相比，反映其活化程度的M2(Mean)值顯著性升高，表明MHCⅡ分子均被激活，并且具有顯著性(P＜0.0001)，提示有細(xì)胞活化信號(hào)產(chǎn)生。
　　7:Ag85A突變體基因敲進(jìn)的DC2.4細(xì)胞系內(nèi)