GSN介導(dǎo)的Vitamin D預(yù)防和治MS-EAE的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，隨著神經(jīng)退行性病變和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，病人出現(xiàn)間歇性神經(jīng)功能障礙，并且逐漸表現(xiàn)出視神經(jīng)炎、肢體癱瘓、感覺(jué)障礙、平衡和協(xié)調(diào)困難、認(rèn)知及睡眠障礙等典型的臨床癥狀。多發(fā)性硬化的發(fā)病原因目前還不明確。在疾病治療方面，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)可以徹底治愈MS的藥物，常用的治療藥物主要集中于免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制劑等治療方面。這些藥物雖然可以在一定

2、程度上緩解病情，降低復(fù)發(fā)率，但治療效果并不令人滿意，而且?guī)缀跛兴幬锒加袊?yán)重的副作用。因此，尋找一種更有效、安全、便利及徹底根治的藥物，是當(dāng)前研究MS治療亟待解決的根本問(wèn)題。
　　Vitamin D在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)方面的作用己廣為人知。近年來(lái)，Vitamin D在免疫系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用逐漸成為熱點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，光照與MS發(fā)病率之間具有密切的相關(guān)性，而光照是生物體內(nèi)Vitamin D合成的催化劑，因此，人們推斷，光照影響了機(jī)

3、體內(nèi)Vitamin D水平，從而影響MS的發(fā)病率。隨后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MS病人體內(nèi)25-(OH)D3的含量明顯低于正常人，說(shuō)明人體內(nèi)VitaminD含量與MS的病程有顯著關(guān)聯(lián)。EAE(experimental autoimmune encephalomye-litis，一種常用的MS動(dòng)物模型)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飲食補(bǔ)充Vitamin D可以有效推遲EAE發(fā)病時(shí)間，緩解病情（本課題組的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆說(shuō)明，Vitam

4、in D與MS的發(fā)生和發(fā)展有顯著的相關(guān)性。然而，Vitamin D在MS/EAE的保護(hù)性機(jī)制仍不明確。故此，研究其間的作用機(jī)制，對(duì)于Vitamin D應(yīng)用于MS的預(yù)防和治療具有重要意義。
　　凝溶膠蛋白(GSN)是人體內(nèi)表達(dá)最廣泛的肌動(dòng)蛋白清除蛋白。它存在兩種亞型:定位在血漿及腦脊液(CSF)中的血漿凝溶膠蛋白(pGSN)和定位在胞漿中的胞漿凝溶膠蛋白(cGSN)。pGSN主要的功能是參與細(xì)胞外肌動(dòng)蛋白清除，也可與炎性介質(zhì)相互作用

5、。cGSN主要在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性以及細(xì)胞凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道，在MS病人和EAE動(dòng)物模型血液中GSN表達(dá)量明顯降低，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在EAE大鼠發(fā)病過(guò)程中pGSN，cGSN的含量都隨EAE的病程而改變，兩者都在EAE發(fā)病過(guò)程中起到了保護(hù)性的作用。然而，本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充Vitamin D的EAE大鼠體內(nèi)（不論EAE發(fā)病與否），GSN的含量均有明顯下降，這提示我們，Vitamin D在預(yù)防和治療EAE中作用有限

6、的原因可能是其下調(diào)了GSN的含量。
　　基于以上設(shè)想，在本研究中，我們采用向EAE大鼠體內(nèi)注射GSN過(guò)表達(dá)病毒(LV-GSN)的方法提高EAE大鼠體內(nèi)GSN的表達(dá)量，以此觀察GSN在EAE發(fā)病過(guò)程中是否具有保護(hù)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提高EAE大鼠體內(nèi)GSN的含量可明顯推遲EAE的發(fā)病時(shí)間，緩解病情。而相比單獨(dú)補(bǔ)充VitaminD或注射(LV-GSN)的EAE大鼠而言，在補(bǔ)充Vitamin D的同時(shí)注射LV-GSN的EAE大鼠，EAE的起始

7、發(fā)病時(shí)間更晚，病情評(píng)分更低。這說(shuō)明，Vitamin D對(duì)GSN的下調(diào)確實(shí)可能削弱了其對(duì)EAE的保護(hù)作用。通過(guò)在PC12細(xì)胞（一種神經(jīng)元研究常用的大鼠細(xì)胞系）中基因干擾和過(guò)表達(dá)的方法，我們發(fā)現(xiàn)，Vitamin D對(duì)GSN的調(diào)控可能是通過(guò)Vitamin D在細(xì)胞內(nèi)的受體——Vitamin D受體(VDR)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，cGSN確實(shí)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起保護(hù)性作用。此外，為系統(tǒng)研究Vitamin D在預(yù)防和治療EAE中的作用機(jī)制，我們

8、還利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法（iTRAQ）對(duì)EAE誘導(dǎo)前后以及Vitamin D補(bǔ)充前后的EAE大鼠脊髓中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（未誘導(dǎo)EAE的正常組）大鼠相比，EAE急性期大鼠脊髓內(nèi)有722種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了改變（篩選標(biāo)準(zhǔn)為:表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍且P-value小于0.05）;而與未補(bǔ)充Vitamin D的EAE急性期大鼠相比，補(bǔ)充VitaminD的EAE急性期大鼠脊髓內(nèi)有184種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了改變（篩選標(biāo)

9、準(zhǔn)為:表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍且P-value小于0.05）。而在EAE發(fā)病前后和Vitamin D補(bǔ)充前后的大鼠脊髓內(nèi)均發(fā)生表達(dá)改變的蛋白質(zhì)有44種。經(jīng)生物信息學(xué)分析，這些蛋白多參與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成，細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡等過(guò)程。后續(xù)的Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證熱休克蛋白27(Heat shock27 kDaprotein1，Hsp27)和凝集素3(Galectin-3，Gal-3)均在EAE急性期有增加（與注射對(duì)照病毒。補(bǔ)充Vit

10、amin D組(VC，VGC，VE，VGE)隔一天向大鼠喂食一次含有維生素D(3μg/day)的飼料，共持續(xù)兩周。并每天觀察記錄各組大鼠的發(fā)病時(shí)間，評(píng)分情況，第12天處死大鼠，檢測(cè)脊髓內(nèi)炎性浸潤(rùn)情況。
　　4.為確定Vitamin D是否被有效的吸收，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，測(cè)定各組大鼠血清中1，25-二羥基維生素D3和25-羥基維生素D3的含量。為確定LV-GSN是否成功提升大鼠體內(nèi)的GSN表達(dá)量，利用Wester

11、n Blot技術(shù)，檢測(cè)LV-GSN注射后大鼠血液和脊髓內(nèi)GSN的表達(dá)。
　　5.Westem Blot和qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠體內(nèi)GSN和VDR的在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　6.Western Blot檢測(cè)梯度濃度1，25(OH)2D3刺激后PC12細(xì)胞內(nèi)GSN和VDR的表達(dá)情況。
　　7.PC12細(xì)胞內(nèi)干擾和過(guò)表達(dá)VDR后，Western Blot檢測(cè)GSN的表達(dá)量，觀察GSN的表達(dá)是否受VDR的調(diào)

12、控。
　　8.PC12細(xì)胞內(nèi)干擾和過(guò)表達(dá)GSN后，Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析cGSN與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.MS病人CSF中GSN的含量明顯低于ONDs病人。
　　2.成功構(gòu)建大鼠的EAE模型:第9天左右EAE大鼠體重開(kāi)始下降，15天左右體重達(dá)到最低，隨后開(kāi)始逐漸恢復(fù)，而正常大鼠體重隨時(shí)間而逐漸增加;評(píng)分方面:EAE大鼠從第9左右天開(kāi)始出現(xiàn)尾巴無(wú)力的癥狀，第12天評(píng)分達(dá)到最

13、高值，而后評(píng)分逐漸降低，第18天左右癥狀完全消失;H&E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EAE大鼠脊髓中有明顯的炎癥浸潤(rùn)。
　　3.注射LV-GSN可明顯推遲EAE大鼠的起始發(fā)病時(shí)間，減少炎性損傷，降低疾病評(píng)分。而補(bǔ)充Vitamin D和注射LV-GSN聯(lián)合使用時(shí)，相較兩者單獨(dú)使用而言，EAE的發(fā)病起始時(shí)間最晚，評(píng)分最低，炎性損傷最少。
　　4.Vitamin D被有效的吸收:補(bǔ)充Vitamin D組大鼠血清中25-羥基維生素D3和1，25-

14、二羥基維生素D3的含量明顯高于未補(bǔ)充Vitamin D組。
　　LV-GSN成功在大鼠體內(nèi)表達(dá): LV-GSN注射后大鼠血液和脊髓內(nèi)GSN的表達(dá)量明顯高于注射對(duì)照病毒組。
　　5.EAE發(fā)病后GSN和VDR的表達(dá)量都有明顯降低，Vitamin D的補(bǔ)充可增加VDR的表達(dá)量而降低GSN的表達(dá)量。
　　6.隨1，25(OH)2D3濃度的增加，GSN表達(dá)量逐漸降低，VDR含量逐漸增加，50nM濃度時(shí)效果明顯。
　　7.

15、Vitamin D可能通過(guò)VDR調(diào)節(jié)GSN的表達(dá):VDR干擾后，GSN表達(dá)量增加，而VDR過(guò)表達(dá)后，GSN表達(dá)量降低。
　　8.cGSN在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中起抗凋亡作用:干擾cGSN后，細(xì)胞凋亡率明顯升高;過(guò)表達(dá)cGSN后細(xì)胞凋亡率降低。
　　結(jié)論:
　　1.過(guò)表達(dá)EAE大鼠體內(nèi)GSN的含量可顯著推遲EAE的起始發(fā)病時(shí)間，緩解EAE病情;
　　2.在補(bǔ)充Vitamin D同時(shí)提升GSN的表達(dá)量可顯著增強(qiáng)Vitami

16、n D預(yù)防和治療EAE的效果，VitaminD下調(diào)GSN的表達(dá)量，可能是VitaminD治療MS作用有限的一個(gè)重要原因;
　　3.Vitamin D可能通過(guò)其受體VDR調(diào)控GSN的表達(dá)。
　　第二部分 EAE大鼠發(fā)病過(guò)程中可能受Vitamin D調(diào)節(jié)的差異蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選研究
　　目的:
　　篩選EAE誘導(dǎo)前后以及Vitamin D補(bǔ)充前后的EAE大鼠脊髓中的差異表達(dá)蛋白，為系統(tǒng)研究Vitamin D預(yù)防和治

17、療EAE/MS的作用機(jī)制提供新的候選蛋白和新的思路。
　　方法:
　　1.EAE大鼠模型的構(gòu)建和Vitamin D的補(bǔ)充:取30只Lewis大鼠，根據(jù)誘導(dǎo)EAE與否分成對(duì)照組（C組，10只）和EAE組（20只），其中EAE組又根據(jù)補(bǔ)充Vitamin D與否分成補(bǔ)充Vitamin DEAE組(VE組，10只)和未補(bǔ)充VitaminDEAE組（E組，10只）。EAE誘導(dǎo)和Vitamin D的補(bǔ)充方法同第一部分。
　　2.利

18、用同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析EAE誘導(dǎo)前后以及Vitamin D補(bǔ)充前后的EAE大鼠脊髓中的差異蛋白:在EAE大鼠發(fā)病急性期（第12天）處死各組大鼠，分別取脊髓提蛋白，蛋白定量后，酶解得到肽段。iTRAQ標(biāo)記肽段，SCX分級(jí)后進(jìn)行梯度Q-exactive分析，共計(jì)15次LC-MS/MS分析，得到原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后通過(guò)分析軟件Proteome Discoverer進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得差異表達(dá)蛋白。
　　

19、3.篩選在EAE發(fā)病前后和Vitamin D補(bǔ)充前后的大鼠脊髓內(nèi)均發(fā)生表達(dá)變化顯著的蛋白.
　　4.通過(guò)基因本體(GO)功能注釋，KEGG等生物信息學(xué)途徑，分析差異蛋白功能屬性，所在通路，和相互間作用網(wǎng)絡(luò)等相關(guān)信息。
　　5.利用Western Blot方法確認(rèn)Hsp27、Gal-3在EAE大鼠脊髓中的表達(dá)變化情況，說(shuō)明Hsp27、Gal-3的表達(dá)量確實(shí)與EAE病程有關(guān)且受到Vitamin D的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)果:

20、>　　1.原始數(shù)據(jù)中，經(jīng)質(zhì)譜定性鑒定，總共發(fā)現(xiàn)有4987種蛋白。其中E組和C組之間(E/C)有722種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了改變(篩選標(biāo)準(zhǔn)為:表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍且P-value小于0.05)，上調(diào)的有438種，下調(diào)的有284種;VE組與E組之間(VE/E)有184種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了改變(篩選標(biāo)準(zhǔn)為:表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍且P-value小于0.05)，上調(diào)的有43種，下調(diào)的有141種。
　　2.在EAE發(fā)病前后和Vitami

21、n D補(bǔ)充前后的大鼠脊髓內(nèi)均發(fā)生表達(dá)變化顯著的蛋白，即E/C和VE/E都有變化的蛋白發(fā)現(xiàn)有44種。
　　3.生物信息學(xué)分析得到每種蛋白的功能和疾病相關(guān)性，相互間網(wǎng)絡(luò)等信息。
　　4.Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Hsp27和Gal-3均在EAE急性期有增加（與對(duì)照組相比），而在補(bǔ)充Vitamin D后有明顯降低，即:E/C上調(diào)，VE/E下調(diào)。這與iTRAQ結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:
　　本研究首次將定量蛋白質(zhì)組學(xué)