醒腦靜對大鼠急性顱腦損傷后腦水腫的治療作用及機制的研究.pdf

1、研究目的： 通過建立SD大鼠自由落體腦創(chuàng)傷模型，觀察腹腔注射XNJ對大鼠急性顱腦創(chuàng)傷后腦水腫、BBB的損害及AQP4的影響，探討其腦保護作用及作用機制。 研究方法： 1.實驗動物 清潔級、健康、成熟SD雄性大鼠108只，體重300～350g。隨機分為假手術組、腦外傷組和XNJ治療組。后兩組再分為傷后1、3、5、7d等4個亞組，每亞組12只。 2.實驗方法 采用參照Feeney'S自由落體模

2、型設計并適當改進的打擊裝置。用20g重的擊錘從30cm高處自由墜落沖擊撞桿，沖擊力為600g·cm，造成腦挫裂傷，制作大鼠腦創(chuàng)傷模型。XNJ治療組在大鼠腦外傷模型做好后10min內腹腔內注射XNJ10mL·kg-1，每天一次。腦外傷組則腹腔內給予等量0.9％氯化鈉溶液，假手術組僅行開顱術，不造成腦損傷。 3.標本采集和檢測 3.1腦組織含水量檢測將大鼠傷后第1、3、5、7d分別斷頭處死后，立即取出傷側大鼠腦組織，110℃

3、恒溫箱烘烤24h至恒重。用干濕質量法計算腦組織含水量。計算公式為：腦組織含水量(％)=(濕質量-干質量)/濕質量×100％。假手術組術后24h做同樣處理。 3.2BBB定量測定采用EB比色法。各組于處死前1h通過股靜脈注射2％EB(3mL·kg-1)。取腦組織前，快速開胸暴露心臟，迅速穿刺左心室后，剪右心房一小口，用37℃生理鹽水500mL灌注，至右心房流出清亮液體。取傷灶周邊腦組織約0.2g，加入5mL甲酰胺，45℃水浴24h

4、，1500r·min-1離心10min，取上清液用HP8453型分光光度計(λ=635nm)測其光密度值。用倍比稀釋法制作標準曲線，再根據標準曲線求得腦組織EB含量，結果以μg·g-1(腦組織)表示。 3.3AQP4免疫組化染色各組大鼠在預定時間點在傷灶區(qū)周圍取腦組織，4％甲醛固定24-48h，石蠟包埋，然后切片行HE染色和免疫組化檢查。以細胞膜呈棕黃色或褐色為AQP4陽性染色。應用NIKON彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析。

5、 3.4腦組織AQP4mRNA的實時熒光RT-PCR測定分別取各組不同時間點的損傷周圍腦組織進行RT-PCR分析，按Trizol試劑說明提取組織總RNA，逆轉錄為cDNA，以逆轉錄所得cDNA為模板進行PCR擴增。AQP4引物：上游5'GGTCCTCATCTCCCTCTGCTT3'，下游5'AACCGTGGTGACTCCCAATCC3'，擴增片段長270bp；β-肌動蛋白引物：上游5'TGTGATGGTGGGTATGGG3'，下游

6、5'TAGAAGCATTTGCGGTGC3'，擴增片段長度為241bp。反應體系50uL，PCR條件：95℃預變性3min；再95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。求得各基因的Ct值。采用2-△△Ct方法，即以管家基因β-肌動蛋白的Ct值標準化目的基因Ct值，得到各時點目的基因初始模板相對量，再計算各時點目的基因初始模板相對量與假手術組目的基因初始模板相對量的比值，分析各時點目的基因AQP4mRNA表達相對

7、量的變化。 4.統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行處理，資料以均數±標準差(-x±s)表示，采用單因素方差分析方法(One-WayANOVA)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 1.各組大鼠腦含水量比較 研究結果： 腦外傷組腦組織含水量傷后1d達高峰，并持續(xù)至第3d，第5d開始下降，第7天仍明顯高于假手術組(P<0.05)。XNJ組腦含水量也在第1d達高峰，后逐漸下降，但均明顯低于腦外

8、傷組(P<0.05)；并于第7d降至接近正常，與假手術組比較無顯著性差異(P>0.05)。 2.各組大鼠腦組織EB含量比較 腦外傷組EB含量傷后1d達高峰，后逐漸下降，各時點均明顯高于假手術組(P<0.05)。XNJ組EB含量傷后1d達高峰，也逐漸下降，各時點均明顯低于腦外傷組(P<0.05)，但均不同程度高于假手術組。 3.腦含水量與EB的相關分析 腦含水量與EB的變化規(guī)律相同，相關分析得，r=0.89

9、8，P<0.01，表明二者具有正性相關。 4.AQP4免疫組化染色和AQP4mRNA 光學顯微鏡下觀察，以細胞膜呈棕黃色或褐色為AQP4陽性染色。腦外傷組傷后1dAQP4免疫染色變深，它的mRNA水平上調，并持續(xù)至第3d，明顯高于假手術組(P<0.05)；在第5d開始下降，與假手術組比較無顯著性差異(P>0.05)。XNJ治療后1、3d的AQP4和AQP4mRNA較腦外傷組明顯上調(P<0.05)。 結論：