輻射誘導的外泌體miRNA介導的人支氣管上皮細胞旁效應研究.pdf

1、電離輻射是能誘發(fā)生物效應、對人類健康產生影響的天然和人為環(huán)境主要物理因素之一。另外，作為醫(yī)學診斷和放射治療的重要技術手段，輻射在醫(yī)學領域的應用在不斷擴大。然而，無論是對接受放射治療的患者還是提供放射治療的醫(yī)師，正確認識和有效的避免輻射帶來的損傷都是十分重要的。因此，研究減少輻射對正常組織產生的旁觀者效應甚至遠期損傷效應都具有重要的意義，這也是放射生物學和放射治療學領域備受關注的長期任務。
　　早在1992年，科學家已經證實電離輻射

2、誘導的損傷不僅發(fā)生于直接受照的細胞，而且在其周圍的未受照細胞也發(fā)生一系列的損傷性改變，稱之為輻射旁效應，輻射誘導的旁效應給周圍正常細胞和組織造成嚴重的危害。近年來的一些研究發(fā)現，輻照細胞產生的一些細胞因子和活性氧等小分子物質參與輻射旁效應，而輻射誘導miRNA的改變以及產生的旁效應也陸續(xù)被報道，為了進一步研究來自受照細胞的外泌體（exosome）miRNA在旁效應中的作用，本研究以人正常支氣管上皮細胞BEP2D作為研究對象，利用輻照處理

3、細胞后，收集照射后的細胞培養(yǎng)基分離其中的外泌體，提取外泌體RNA并通過miRNA芯片技術分析外泌體中miRNA的表達譜變化，篩選出對輻射響應較為明顯的miRNA并且進一步驗證，然后，對這些輻射誘導的外泌體miRNA在旁效應中的作用及機制展開了深入研究。
　　目的：鑒定來源于輻照細胞的外泌體中miRNA表達譜，獲得輻射誘導表達的外泌體miRNA信息，研究其中部分miRNA（miR-7-5p和miR-1246）對人支氣管上皮細胞BEP

4、2D產生的旁效應及相關機制。
　　方法：利用梯度超速離心法從培養(yǎng)液收集細胞分泌的外泌體；在透射電鏡下觀察并鑒定細胞分泌的外泌體形態(tài)；提取來源于照射和對照細胞外泌體中的RNA做miRNA芯片鑒定，選擇外泌體中受輻射影響較明顯的miR-7-5p和miR-1246作為研究對象，做進一步的效應研究；通過RT-qPCR技術驗證miRNA分子的差異表達變化；通過CCK-8實驗檢測細胞增殖活性變化；通過流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期的變化；利

5、用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察外泌體在人支氣管上皮細胞BEP2D中的攝入和miR-7-5p對細胞自噬泡產生的影響；通過western blot方法檢自噬相關蛋白LC3B、Beclin1、p62以及自噬相關信號通路調節(jié)蛋白的表達變化；通過免疫熒光原位雜交技術檢測BEP2D細胞中DNA損傷相關蛋白53BP1的foci形成、以及微核檢測實驗來分析DNA損傷情況。
　　結果：（1）正常的人支氣管上皮細胞照射后的外泌體中miRNA的表達譜發(fā)生明

6、顯的變化，在照射后4hr外泌體中有6個miRNAs表達上調，6個miRNAs表達下調，照射后8hr外泌體中則有4個miRNAs表達上調，7個miRNAs表達下調，其中miR-7-5p和miR-1246在照射后4hr和8hr出現表達持續(xù)上調，而細胞內的miR-7-5p以及miR-1246在照射后4hr的表達明顯降低（p<0.01）；（2）增加miR-7-5p表達明顯抑制細胞的增殖，細胞的自噬顯著（p<0.05），表現為細胞內自噬泡增多、自

7、噬相關蛋白LC3B和Beclin1的表達明顯增加，p62的降解也增加。增加miR-7-5p表達對細胞凋亡和細胞周期無明顯作用（p>0.05）；（3）細胞分泌的外泌體能夠被未照射的人支氣管上皮細胞BEP2D有效攝入，而且在未照射的人支氣管上皮細胞BEP2D中檢測到miR-7-5p的表達明顯增加（p<0.05）；（4）含miR-7-5p的外泌體處理未照射的人支氣管上皮細胞BEP2D后，也導致細胞增殖抑制和自噬增加，miR-7-5p抑制劑能夠

8、逆轉或減弱上述作用；（5)miR-7-5p誘導細胞自噬主要通過抑制靶基因EGFR的作用，對自噬相關信號通路中的AKT和mTOR的磷酸化也有明顯的抑制作用，miR-7-5p抑制劑處理后抑制作用消失，外泌體miR-7-5p有同樣的作用；（6）2Gy照射人支氣管上皮細胞BEP2D后4hr收集的條件培養(yǎng)液能導致細胞的微核數目明顯增加（p<0.05），DNA損傷相關蛋白53BP1的聚焦點（foci）形成增多（p<0.05），即顯示出基因組DNA損

9、傷效應；（7）進一步發(fā)現增加外泌體miR-1246表達能誘導不同的未照射細胞產生微核（p<0.05），促進DNA損傷相關蛋白53BP1聚焦點（foci）形成（p<0.05）。
　　結論：
　　本課題主要以正常的人支氣管上皮細胞BEP2D作為研究對象，鑒定了輻射誘導表達增加的外泌體miRNA分子，探討了其生物學效應，研究結論總結如下：
　　1:輻射誘導正常的人支氣管上皮細胞BEP2D分泌外泌體到細胞外微環(huán)境中，照射后的外

10、泌體miRNA表達譜發(fā)生明顯的改變；
　　2:照射后的外泌體中miR-7-5p和miR-1246在照后的一段時間內都出現表達持續(xù)上調的現象，而此時的細胞內則出現miRNA表達降低；
　　3:輻射誘導的外泌體miR-7-5p通過誘導細胞發(fā)生自噬而抑制細胞增殖，其作用機制主要是通過對靶基因EGFR的調控下，影響了其下游的自噬相關通路AKT/mTOR，通過EGFR/AKT/mTOR軸調節(jié)細胞自噬；
　　4:輻射誘導的外泌體m