核轉(zhuǎn)錄因子Snail調(diào)控二氧化硅誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究核轉(zhuǎn)錄因子Snail在二氧化硅(SiO2)誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)中的作用機(jī)制。
　　 方法：以200μ g/mlSiO2刺激的HBE細(xì)胞為模型，⑴不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、6、12、18、24h)用倒置顯微鏡觀察HBE細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；⑵不同時(shí)間點(diǎn)(0、24h)用電子顯微鏡觀察HBE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；⑶不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、6、12、18、24h)用Western-Blot檢測(cè)HBE細(xì)胞Snai

2、l總蛋白表達(dá)水平的變化；⑷不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、6、12、18、24h)用Western-Blot檢測(cè)HBE細(xì)胞Snail核蛋白表達(dá)水平的變化；⑸不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、6、12、18、24h)用免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)HBE細(xì)胞Snail的核定位情況；⑹不同時(shí)間點(diǎn)(0、12、18h)用EMSA檢測(cè)HBE細(xì)胞Snail DNA結(jié)合活性的變化情況；(7)RNA干擾Snail的表達(dá)后，Western-Blot檢測(cè)HBE細(xì)胞Snail、α-SMA、Vime

3、ntin、E-cad蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：⑴倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：HBE細(xì)胞與SiO2共育后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原呈鋪路石樣排列的HBE細(xì)胞出現(xiàn)梭形、紡錘形改變，間隙略微增寬。⑵電鏡結(jié)果顯示：對(duì)照組的細(xì)胞大多為圓形，表面微絨毛豐富；SiO2誘導(dǎo)HBE細(xì)胞24h時(shí)梭形多見(jiàn)，細(xì)胞核多形性，細(xì)胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)減少甚至缺失，代之表現(xiàn)為突起，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量管狀結(jié)構(gòu)，次級(jí)溶酶體內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞吞噬的SiO2顆粒。⑶Western-bl

4、ot檢測(cè)總蛋白的結(jié)果顯示：在SiO2作用下，Snail表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上調(diào)，18h表達(dá)達(dá)到頂峰，之后逐漸下降；12h組和18h組Snail蛋白的表達(dá)水平分別為(2.88±0.63)和(4.51±1.15)，與對(duì)照組的(0.57±0.04)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.05)。⑷Western-blot檢測(cè)核蛋白的結(jié)果顯示：在SiO2作用下，Snail表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上調(diào)，12h表達(dá)達(dá)到頂峰，之后逐漸下降；12h組和18h

5、組Snail蛋白的表達(dá)水平分別為(4.51±0.81)和(2.76±0.77)，與對(duì)照組的(0.67±0.15)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑸免疫細(xì)胞熒光結(jié)果顯示：對(duì)照組可見(jiàn)到微弱熒光表達(dá)于胞漿，核內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組熒光主要表達(dá)于細(xì)胞核，隨著SiO2作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Snail表達(dá)逐漸向核內(nèi)移位。⑺EMSA結(jié)果顯示：在SiO2作用下，12h組和18h組Snail DNA結(jié)合活性的表達(dá)水平分別為(0.020±0.00047)和

6、(0.023±0.0011)，與對(duì)照組的(0.0014±0.00026)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明SnailDNA結(jié)合活性明顯升高。⑺siRNA結(jié)果顯示：①刺激組和干擾組Snail蛋白的表達(dá)水平分別為(20.02±1.44)和(6.73±1.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明siRNA干擾后Snail表達(dá)下調(diào)，抑制率為66.38％；②刺激組和干擾組E-cad蛋白的表達(dá)水平分別為(0.18±0.03)和(0

7、.84±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明siRNA干擾后E-cad表達(dá)上調(diào)：③刺激組和干擾組α-SMA和vimentin蛋白的表達(dá)水平分別為(2.35±0.45)和(0.23±0.05)，(13.12±1.09)和(2.33±0.54)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明siRNA干擾后α-SMA和vimentin表達(dá)下調(diào)，抑制率分別為90.21％和82.24％。
　　 結(jié)論：①SiO2可誘導(dǎo)人支氣管上皮