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1、目的:研究二氧化硅(Si02)體外誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)及MAPK信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用機(jī)制。
方法:(1)倒置顯微鏡觀察Si02處理HBE細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變;(2)用不同濃度矽塵(0μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,300μg/ml)處理HBE細(xì)胞72h后WestemBlot檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-S
2、MA)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)蛋白表達(dá)水平的改變;(3)采用MAPK活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Si02處理HBE細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(Oh,0.5h,lh,2h,4h,8h)ERK和p38活性改變;(4)WesternBlot檢測(cè)經(jīng)不同濃度ERK、p38特異性抑制劑U0126和SB203580(10μM,20μM,30μM)預(yù)處理lh后,矽塵誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞E-cadhefin、α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)的改變;(5)免
3、疫印跡檢測(cè)30μMM的U0126和SB203580兩者共同干預(yù)HBE細(xì)胞后E-cadhefin、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)的改變。
結(jié)果:(1)Si02處理HBE細(xì)胞后,Si02濃度在200μg/ml細(xì)胞形態(tài)變化最明顯,細(xì)胞失去了鋪路石樣改變,呈梭形、紡錘形;(2)不同濃度Si02(0,50,100,200,300μg/ml)處理HBE細(xì)胞72h后,隨著Si02濃度的升高,E-cad表達(dá)逐漸降低,α-SMA和Vi
4、mentin表達(dá)逐漸升高,在Si02濃度為200μg/ml時(shí)E-cad蛋白表達(dá)水平(1.42±0.10)明顯低于對(duì)照組的表達(dá)水平(3.74+0.95)(P<0.05),E-cad在SiO2濃度為300μg/ml時(shí)最低,并且在100、200、300μg/ml組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);而α-SMA在Si02濃度為200μg/ml時(shí)達(dá)到高峰,為對(duì)照組的(5.09±1.98)倍,在200~300μg/ml時(shí)α-SMA表達(dá)略有下降,但仍高
5、于對(duì)照組(P<0.05);Vimentin在Si02濃度為300μg/ml時(shí)最高,為對(duì)照組的(7.30±3.02)倍,在200、300μg/ml組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);(3)Si02作用于HBE細(xì)胞能誘導(dǎo)ERK和p38激酶活化,于30min開始出現(xiàn)ERK和p38磷酸化水平增高,分別于60min和30min之后逐漸減弱;(4)干預(yù)實(shí)驗(yàn),免疫印跡結(jié)果顯示,U0126(20,30μpM)干預(yù)組,E-cadherin蛋白表達(dá)分別為Si
6、02(200μg/ml)處理組的(2.52±0.87)倍和(3.17±0.88)倍(P<0.05),30μM的U0126預(yù)處理后,α-SMA和Vimentin表達(dá)減少,抑制率分別為40.43%和60.33%(P<0.05);SB203580(30μM)干預(yù)組,E-cadherin表達(dá)為SiO2(200μg/ml)處理組的(1.77±0.26)倍(P<0.05),α-SMA和Vimentin表達(dá)減少,抑制率分別為34.67%和55.44%
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