蟲草菌液抑制CSE誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病是一種進(jìn)展性致殘性疾病，在有害因素的刺激下，氣道和肺產(chǎn)生異常炎癥反應(yīng)。COPD的主要特點(diǎn)是持續(xù)氣流受限和不完全可逆的的氣道炎癥。
　　對COPD的細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)以及遺傳學(xué)病因仍缺乏充分的了解，目前的治療都存在其不足，不能有效延緩疾病的進(jìn)展或降低死亡率。
　　目前的研究證實(shí)，在老齡化人群中，因衰老過程加速可同時患有有多種疾病，被稱為共生疾病(multimorbidity)。包括COPD、冠心病、代謝性疾病以及神

2、經(jīng)系統(tǒng)退變等慢性退行性疾病，他們有著共同的發(fā)病機(jī)制，與細(xì)胞的衰老加速密切相關(guān)。
　　細(xì)胞衰老是由各種壓力導(dǎo)致不可逆的生長停滯狀態(tài)的過程。老化過程中衰老細(xì)胞積聚，導(dǎo)致一系列衰老相關(guān)性疾病。研究證實(shí)，細(xì)胞衰老是共生疾病的共同原因。引起細(xì)胞衰老加速的機(jī)制涉及到端粒的縮短，PI3K/AKT/ mTor通路的活化，自噬受損，線粒體功能障礙，干細(xì)胞耗竭，免疫衰老等。很多這些途徑由慢性氧化應(yīng)激驅(qū)動。
　　氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞衰老的重要原因。

3、在有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)對大多數(shù)細(xì)胞都具有毒性作用。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和ROS清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。如果ROS產(chǎn)生增多或/和機(jī)體清除ROS能力的下降，機(jī)體就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激(oxidative stress)。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，體內(nèi)組織細(xì)胞ROS量相對升高，超過機(jī)體的清除能力，可導(dǎo)致機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，對機(jī)

4、體造成損害。在COPD患者中，氧化應(yīng)激主要來源于煙霧中的氧化劑和體內(nèi)活化的炎癥細(xì)胞，吸煙與ROS及氧化應(yīng)激密切相關(guān)。ROS活化PI3K，通過AKT激酶活化mTor，激活PI3K/AKT/ mTor通路。PI3K/AKT/ mTor通路作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程。在細(xì)胞的衰老過程中，該通路也起著至關(guān)重要的作用。H3K/AKT/mTor通路活化后，通過ULK1的激活和抑制S

5、IRT1的活性，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老。
　　綜上所述，抑制細(xì)胞衰老的加速，對COPD以及其他共生疾病有一定的治療作用。
　　近年來，從我國傳統(tǒng)中草藥中提取藥物治療慢性疾病已經(jīng)成為當(dāng)前國內(nèi)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要組成部分。冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)，又名蟲草，是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合物，是世界上目前最稀有珍貴的藥用真菌之一，有極高的醫(yī)療保健作用和經(jīng)濟(jì)價值，具有抗衰老、抗病

6、原微生物、抗惡性腫瘤、擴(kuò)張血管、改善動脈硬化癥、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、呼吸、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟和肝臟等多種功效。
　　現(xiàn)在對于蟲草的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用。蟲草中含有核苷、多糖、甾醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽等，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。但冬蟲夏草的具體作用機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草可以降低人肺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，抗氧化是冬蟲夏草的重要作用機(jī)制。呼吸系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激主要來源于煙霧，與細(xì)胞衰

7、老密切相關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)擬研究蟲草菌液對于CSE(香煙煙霧提取物，Cigarette SmokeExtract)誘發(fā)的細(xì)胞哀老的抑制作用及其機(jī)制。從細(xì)胞分子機(jī)制延緩COPD細(xì)胞的衰老，對以后COPD病人的疾病預(yù)防及治療提供一定的價值。
　　目的：
　　1.探討CSE對人支氣管上皮細(xì)胞存活率的影響。
　　2.研究CSE誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞衰老。
　　3.研究冬蟲夏草菌液對于CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞的衰老的抑制作用。<

8、br>　　4.研究ROS和PI3K/AKT/mTor通路在CSE誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用。
　　5.探討CSE和蟲草菌液對于細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)進(jìn)行體外培養(yǎng)，用不同濃度CSE對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)不同時間，以MTT法測定細(xì)胞存活率，測定CSE對上皮細(xì)胞存活率的影響，確定最合適干預(yù)的CSE濃度和時間。
　　2.16HBE細(xì)胞經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)確定的濃度和時間的CSE干預(yù)后，通過SA

9、-β-gal染色法和P16、P21檢測細(xì)胞衰老。通過對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶染色，計算視野中染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，與對照組進(jìn)行對比，P＜0.05具有顯著差異。P16和P21的檢測通過免疫熒光化學(xué)技術(shù)定性，實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)測定mRNA相對表達(dá)，以及免疫蛋白印跡法測定蛋白表達(dá)定量。同時，以梯度CSE處理細(xì)胞，免疫蛋白印跡法測定P16和P21的蛋白表達(dá)。
　　3.在實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行CSE干預(yù)的兩小時前加入CS（蟲草菌液，Cordy

10、ceps sinensis），細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測。測定β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率，免疫熒光、實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)、免疫蛋白印跡測定P16、P21表達(dá)。
　　4.為測定ROS和PI3K/AKT/mTor通路的活化，16HBE細(xì)胞經(jīng)過CSE、CS處理后，通過ROS試劑盒檢測ROS熒光，定性分析不同干預(yù)條件下ROS變化;通過免疫蛋白印跡測定PI3K、AKT、mTor蛋白表達(dá)以及它們的磷酸化蛋白表達(dá);以梯度CSE處理細(xì)胞，

11、免疫蛋白印跡法測定AKT、mTor的磷酸化蛋白表達(dá)。
　　5.為了研究CSE和蟲草菌液對于細(xì)胞衰老的作用機(jī)制，在CSE組、CS+CSE組中，我們分別加入ROS抑制劑NAC、PI3KK抑制劑Ly294002，測定ROS熒光強(qiáng)度、PI3K/AKT/mTor以及它們的磷酸化蛋白表達(dá)，以觀察加入抑制劑后對細(xì)胞通路的影響，測定β-半乳糖苷酶染色和P16、P21的蛋白表達(dá)觀察對細(xì)胞衰老的影響。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過CSE處理后

12、，16HBE細(xì)胞存活率被抑制，呈時間和濃度依賴性。根據(jù)MTT法繪制細(xì)胞生存率曲線，2％CSE作用24小時用于之后的干預(yù)研究。
　　2.經(jīng)過CSEE處理后，16HBE細(xì)胞的衰老增強(qiáng)。對比對照組，SA-β-gal染色陽性細(xì)胞比率增高(p＜0.05)，P16和P21的免疫化學(xué)熒光增強(qiáng)，P16和P21的mRNA相對表達(dá)增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05），P16和P21蛋白表達(dá)量增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。P16和P

13、21的蛋白表達(dá)量隨CSE的作用濃度和作用時間而增加(分別為:p＜0.05，p＜0.05)。
　　3.與CSE處理細(xì)胞組進(jìn)行對比，在CSEE干預(yù)前加入CS組細(xì)胞的衰老減弱。與CSE組對比，CSE+CS組的SA-β-gal染色陽性細(xì)胞比率降低(p＜0.05)，P16和P21的免疫化學(xué)熒光減弱，mRNA相對表達(dá)減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05），蛋白表達(dá)量減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。
　　4.與對照組相比較

14、，CSE組細(xì)胞ROS熒光增強(qiáng)，PI3K、AKT、mTor蛋白表達(dá)無差異，AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。對比CSE組，預(yù)先加入CS組細(xì)胞的ROS熒光減弱，PI3K、AKT、mTor蛋白表達(dá)無差異，AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)呈CSE濃度和時間依賴性（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。
　　5.加入ROS抑制劑N

15、AC后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞的ROS熒光均呈明顯減弱，AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)均減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），由此，ROS和PI3K/AKT/mTor信號通路活化降低;加入NAC后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞衰老減弱，表現(xiàn)為SA-β-gal染色陽性細(xì)胞的比率均有降低(分別為:p＜0.05，p＜0.05)、P16和P21蛋白表達(dá)均呈下降(分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.

16、05，p＜0.05)。
　　加入PI3K抑制劑Ly294002后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞的AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)明顯減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），由此，信號通路活化降低，但ROS熒光變化不明顯，PI3K抑制劑對ROS影響不大;加入Ly294002后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞衰老減弱，表現(xiàn)為SA-β-gal染色陽性細(xì)胞的比率均有降低（分別為:p＜0.05，p＜0.05）、P

17、16和P21蛋白表達(dá)均呈下降(分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.CSE抑制人支氣管上皮細(xì)胞存活率，呈時間和濃度依賴性。
　　2.CSE可以誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞衰老。
　　3.CS在體外細(xì)胞培養(yǎng)中能抑制CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
　　4.ROS和P13K/AKT/mTor信號通路在CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中起著重要的作用。
　　5.阻斷ROS/mTor信號通