FMDV3C蛋白酶抑制G3BP1介導的應激顆粒形成的分子機制.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是一種由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的，具有高度傳染性的，能在牛、豬、羊等偶蹄類動物中廣泛傳播的疾病。其臨床癥狀表現為體質虛弱，以及蹄、下肢和口部水皰的形成，具有高發(fā)病率和低死亡率的特點，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經濟損失。FMDV感染宿主后能夠逃避宿主免疫，其3C蛋白酶(3C proteinase，3Cpro)在其中發(fā)揮了重要作

2、用，但具體機制還不是十分清楚。
　　應激顆粒(stress granules，SGs)是真核細胞受環(huán)境刺激（包括病毒感染）時，蛋白翻譯起始暫停，翻譯起始復合物與核糖體40S亞基以及許多RNA結合蛋白在胞質中聚集形成的致密顆粒，是細胞應對環(huán)境刺激的一種保護性機制。許多研究表明，包括小RNA病毒在內的許多病毒在感染細胞后能以各種方式影響SGs的形成，同時細胞產生的SGs也能從不同層面影響病毒增殖。鑒于此，本課題以FMDV為對象，研究F

3、MDV感染對SGs形成的影響及其分子機制。具體內容如下:
　　1.FMDV不誘導SGs形成及3Cpro切割G3BP1以G3BP1作為SGs的生物標記，通過間接免疫熒光試驗(IFA)分別檢測FMDV感染和亞硝酸鹽（Arsenite，ARS）處理的IBRS-2細胞中SGs的形成情況。結果顯示，相比未處理組，ARS處理的IBRS-2細胞可以正常產生SGs，而FMDV感染不誘導SGs形成，且G3BP1含量顯著下降，推測病毒蛋白酶有可能參與

4、下調G3BP1的表達。將FMDV蛋白酶Lpro、3Cpro及其前體蛋白分別與G3BP1共轉染HEK-293T細胞中，Western Blot檢測G3BP1的表達情況。結果顯示3Cpro及其前體蛋白可以切割G3 BP1，且切割效應呈現劑量依賴性。
　　2.FMDV3Cpro的蛋白酶活性參與切割G3BP1及抑制SGs的形成將3Cpro三個關鍵的蛋白酶活性位點分別進行突變，然后與G3BP1共轉染293T細胞，Western Blot檢測

5、發(fā)現，蛋白酶活性突變的3Cpro不能切割G3BP1，說明3Cpro的蛋白酶活性參與切割G3BP1。進一步將3Cpro及蛋白酶活性突變體3CC163G分別轉染293T細胞，ARS刺激后觀察SGs的產生。通過IFA發(fā)現，超表達3Cpro的293T細胞沒有SGs產生，而轉染了3CC163G的細胞則能形成正常的SGs，表明3Cpr能夠抑制SGs生成，且與其蛋白酶活性有關。此外，在添加蛋白酶體途徑抑制劑MG-132或細胞凋亡抑制劑Z-VAD后，W

6、estern Blot仍然能夠檢測到3Cpro切割G3BP1，說明這種切割效應是特異性的，不依賴蛋白酶體及細胞凋亡途徑。
　　3.FMDV3Cpro切割G3BP1的位點鑒定根據G3BP1切割條帶大小及3Cpro的切割底物的特點，構建了一系列G3BP1的位點突變體。通過Western Blot檢測發(fā)現，將G3BP1第284位谷氨酸(Glutamic acid，Glu)突變后，3Cpro不再切割G3BP1，說明切割位點在284位Glu