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文檔簡介
1、研究背景:
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是指由于各種原因造成的腦和脊髓的損傷以及神經(jīng)功能障礙,而神經(jīng)元損傷及功能障礙被認(rèn)為是最為重要的機(jī)制之一。以往研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元損傷的相關(guān)機(jī)制主要包括谷氨酸興奮性毒性、鈣離子超載、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等,其中研究最為深入的是由谷氨酸、谷氨酸受體及鈣離子代謝介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)損傷相關(guān)機(jī)制。但是仍有很多問題沒有解決,如 mGluR5在神經(jīng)元損傷中的作用,以及綜合調(diào)控外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放對(duì)神經(jīng)元損傷的影響等。Hom
2、er1蛋白是一類新型的突觸后致密物質(zhì),在神經(jīng)元功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用。我們以往的研究表明,在創(chuàng)傷性神經(jīng)元損傷后,Homer1a表達(dá)明顯增高,可能通過影響I組mGluRs在突觸后膜上的錨定影響神經(jīng)元損傷。然而,Homer1b/c和Homer1a在神經(jīng)元損傷中究竟發(fā)揮什么樣的作用,其具體分子機(jī)制如何尚不清楚。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> 本研究的目的是:(1)以鈣離子代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)為切入點(diǎn),初步探討谷氨酸所致神經(jīng)元損傷的機(jī)制,研究
3、mGluR5在神經(jīng)元損傷中的作用;(2)研究鈣庫調(diào)節(jié)鈣離子通道在神經(jīng)元損傷中的作用,探討其阻滯劑神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制;(3)研究 Homer1b/c在神經(jīng)元損傷中的作用,明確其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙的關(guān)系;(4)研究Homer1a在神經(jīng)元損傷中的作用,明確其與神經(jīng)元外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放調(diào)控的關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)方法
(1)細(xì)胞培養(yǎng):原代小鼠皮層神經(jīng)元離體培養(yǎng);(2)離體神經(jīng)元損傷模型:谷氨酸損傷模型;(3)在體神經(jīng)元損
4、傷模型:小鼠重物下落閉合性腦損傷模型;(4)離體神經(jīng)元損傷評(píng)價(jià):細(xì)胞活力檢測、LDH釋放檢測、Caspase-3活性檢測和神經(jīng)元凋亡染色;(5)在體神經(jīng)元損傷評(píng)價(jià):腦組織含水量檢測、腦組織缺損檢測、神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和神經(jīng)元凋亡TUNEL染色;(6)基因表達(dá)調(diào)控:采用慢病毒介導(dǎo)的基因沉默與基因過表達(dá)技術(shù)上調(diào)/下調(diào)Homer1b/c和Homer1a的表達(dá);(7)分子表達(dá):分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、免疫熒光、免疫組織
5、化學(xué)方法檢測各種分子的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
(1)谷氨酸引起的興奮性神經(jīng)元損傷是一種鈣離子依賴性的氧化應(yīng)激性損傷;mGluR5激活對(duì)谷氨酸引起的興奮性神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用;mGluR5通過PKC-ERK信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;mGluR5在TBI模型中發(fā)揮有限的神經(jīng)保護(hù)作用;(2) SKF-96365減輕谷氨酸所致興奮性神經(jīng)元損傷;SKF-96365通過Homer1-Ca2+信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;(3)下調(diào)Ho
6、mer1b/c減輕谷氨酸所致興奮性神經(jīng)元損傷;下調(diào)Homer1b/c抑制谷氨酸所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放;下調(diào)Homer1b/c減輕谷氨酸所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;下調(diào)Homer1b/c保護(hù)谷氨酸損傷后的線粒體功能;(4)過表達(dá)Homer1a減輕谷氨酸所致興奮性神經(jīng)元損傷;過表達(dá)Homer1a綜合調(diào)控外鈣內(nèi)流與內(nèi)鈣釋放。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
?。?)谷氨酸所致神經(jīng)元損傷是一種鈣離子依賴性的氧化應(yīng)激性損傷,激活mGluR5有減輕神經(jīng)元損傷作用
7、。(2)鈣庫調(diào)節(jié)鈣通道的非特異性離子通道阻滯劑SKF-96365可通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,減輕谷氨酸所致神經(jīng)元損傷,其神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮并不依賴于TRPC離子通道表達(dá)的變化,而與對(duì)Homer1功能抑制有關(guān)。(3)下調(diào) Homer1b/c的表達(dá)可以減輕神經(jīng)元損傷,抑制神經(jīng)元凋亡,這種神經(jīng)保護(hù)作用與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和保護(hù)線粒體功能有關(guān)。(4)過表達(dá)Homer1a可通過抑制ROS相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷減輕神經(jīng)元凋亡,這種神經(jīng)保護(hù)作用與綜合調(diào)
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