誘導骨髓間充質干細胞表達解蛋白的信號機制及MSCs治療性應用的初步研究.pdf

1、本研究共為五個部分,前三部分以目前實驗室已建立的骨髓間質干細胞誘導表達表皮細胞角蛋白實驗為基礎,探討骨髓間質干細胞在誘導條件下向皮膚表皮分化中的MAPK信號轉導,探討分化轉換機制。第四部分為動物實驗,觀察HA1077促進骨髓間質干細胞修復創(chuàng)面的作用。第五部分為臨床病例觀察,在體外實驗的基礎上,在臨床上選擇老年性慢性褥瘡,觀察異體MSCs創(chuàng)面移植對創(chuàng)面愈合的作用,為進一步治療提供依據(jù)。
　　 第一部分:p38、ERK信號阻斷對大鼠

2、骨髓間充質干細胞表達表皮細胞角蛋白的影響
　　 目的：探討ERK、p38兩條信號通路對大鼠骨髓間充質干細胞誘導表達表皮細胞角蛋白的影響。
　　 方法：采用Ficoll-Paque淋巴細胞分離液分離擴增大鼠骨髓MSCs,免疫細胞化學及流式細胞儀進行表面標志的檢測。對照組采用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,誘導組采用條件培養(yǎng)基等定向誘導MSCs分化表達角蛋白；p38阻斷組在誘導條件下加入p38抑制劑SB203580,ERK阻

3、斷組在誘導條件下加入ERK抑制劑PD98059,培養(yǎng)7天后免疫細胞化學及流式細胞儀對細胞角蛋白CK5/8、CK19進行檢測。
　　 結果：大鼠骨髓MSC可在體外擴增15代,免疫細胞化學及流式細胞儀檢測試結果顯示CD29、CD44表達陽性,CD34、CD45表達陰性。7天后流式細胞儀顯示誘導組CK5/8、CK19陽性率分別為3.01％、6.47％；p38阻斷組CK5/8、CK19陽性表達率分別為1.43％、5.41％,低于誘導組(

4、P<0.01)；ERK阻斷組CK5/8、CK19陽性表達率分別為5.54％、7.56％,高于誘導組(P<0.01)。油紅0脂肪染色發(fā)現(xiàn)p38阻斷組有少量陽性表達細胞,其它組均為陰性。
　　 結論：抑制p38途徑的激活,在一定程度上抑制MSC分化表達表皮細胞角蛋白,且促使少量MSC分化為脂肪細胞。表明p38途徑在促進MSC分化為表皮細胞過程中起積極作用。
　　 第二部分 Rho信號阻斷對骨髓間充質干細胞表達角蛋白的影響

5、r>　　 目的：探討大鼠骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)分化表達表皮細胞角蛋白過程中,Rho信號阻斷對其影響。
　　 方法：(1)采用Ficoll-Paque淋巴細胞分離液分離擴增大鼠骨髓MSCs,免疫細胞化學及流式細胞儀進行表面標志的檢測。(2)定向誘導中磷酸化P38和ERK表達:分為正常對照組、單純誘導組、Rho阻斷組；培養(yǎng)1、3、5、7d后,流式細胞檢測磷酸化P38和ERK。(3

6、)HA1077對CK5/8、CK19的影響:第3代的大鼠MSCs接種培養(yǎng)瓶。對照組加入D MEM完全培養(yǎng)液；誘導組:70％完全培養(yǎng)液+30％大鼠成纖維細胞上清液+8ngEGF的培養(yǎng)液；Rho阻斷1組:在誘導液基礎上,同時加入終濃度為10umol/L的HA1077；Rho阻斷2組:在誘導液基礎上,同時加入終濃度為30umol/L的HA1077。取培養(yǎng)7天的細胞,流式細胞檢測CK5/8、CK19表達。
　　 結果：(1)大鼠骨髓MS

7、Cs在體外擴增后,免疫細胞化學及流式細胞儀檢測結果顯示CD29、CD44表達陽性,CD34、CD45表達陰性。(2)磷酸化P38正常對照水平為0.02％。在誘導組1d(0.01％)、3d(0.01％)變化不大,誘導5d為0.04％,明顯升高,7d時(0.01％)復接近誘導前水平；磷酸化ERK對照水平為4.23％,誘導后3d(0.39％)、5d(0.40％)均呈下降趨勢,7天時(5.10％)恢復至誘導前水平。Rho阻斷組:磷酸化P38水平

8、在1d、3d、5d和7d,分別為1.11％、71.19％、0.25％、6.86％,均升高:ERK磷酸化在1d、3d、5d和7d,分別為6.17％、4.13％、3.97％和0.41％,其中7d低于對照水平。(3)HA1077對CK5/8、CK19的影響:經(jīng)流式細胞檢測,對照組,CK5/8為0.58％,CK19為2.04％。單純誘導組CK5/8為1.81％,CK19為10.19％。加入HA1077后,Rho阻斷1組:在誘導液基礎上,CK5/

9、8為21.65％,CK19為39.41％,與單純誘導組相比,升高顯著,P<0.01。Rho阻斷2組:CK5/8為21.07％,CK19為45.60％,與單純誘導組相比,升高顯著,P<0.01。
　　 結論：上游信號Rho阻斷后增加p38途徑途徑激活,一定程度上促進MSC分化表達角蛋白。
　　 第三部分 HA-1077對人骨髓間充質干細胞向表皮細胞表型誘導中細胞周期影響
　　 目的：觀察HA-1077對人骨髓間充質

10、干細胞向表皮細胞表型誘導中細胞周期影響。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)入骨髓間充質干細胞(MSCs),分為分為3組:①對照組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM)；②誘導組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+8ng/mlEGF)；③HA-1077阻斷組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+8ng/mlEGF+10μmol/L HA-1077)。流式細胞檢測各組誘導7天后PCNA和細胞周

11、期。
　　 結果：誘導7天后對照組、誘導組、HA1077阻斷組PCNA的陽性表達率分別為:(3.31±0.76)％、(9.78±3.33)％、(10.72±1.05)％,HA1077阻斷組最高。細胞周期分析發(fā)現(xiàn):對照組、誘導組、HA1077阻斷組處于G0/G1期的細胞逐漸減少,分別為(91.64±0.33)％、(87.83±0.47)％、(76.80±2.97)％；處于S期的比例分別為:(7.99±0.47)％、(11.74±0

12、.63)％、(20.21±1.01)％。HA1077阻斷組最高。
　　 結論： HA1077促進MSCs進入S期,并且表達PCNA增加。
　　 第四部分 HA1077促進骨髓間充質干細胞修復創(chuàng)面的在體實驗研究
　　 目的：觀察鹽酸法舒地爾促進骨髓間充質干細胞修復全層皮膚缺損的作用。
　　 方法：1.骨髓間充質干細胞及誘導細胞的培養(yǎng):按前述方法取MSCs進行實驗,而誘導細胞則采用經(jīng)誘導培養(yǎng)液(70％完全培養(yǎng)

13、液+30％成纖維細胞培養(yǎng)基上清液+8 ng/EGF)誘導后7d的細胞進行實驗。2.取新西蘭大耳白兔12只,按無菌手術要求在背部脊柱兩側1cm處由前至后制備6個直徑為3cm的圓形皮膚缺損(每側各3個)。創(chuàng)面隨機分為空白對照組(A組)、EGF對照組(B組)、MSCs治療組(C組)、誘導細胞治療組(D組)、MSCs+HA1077治療組(E組)和誘導細胞+HA1077治療組(F組),每組各12個創(chuàng)面。創(chuàng)面按分組要求注射藥品,MSCs及誘導細胞細

14、胞濃度均為2×106/ml,每個創(chuàng)面注射細胞懸液1ml,HA1077則按濃度20μmol/L注射每一創(chuàng)面注射0.5ml,(除空白對照組外)各組創(chuàng)面均注射濃度為50U/cm2創(chuàng)面的EGF。腹腔注射抗生素鹽水10ml。隔日按各組要求注射藥品和細胞。傷后3、7、14d用透明膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣描膜,計算愈合指數(shù)(WCI),WCI=(1-處理后創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×10Q％。并記錄各創(chuàng)面愈合時間,比較各組間差異。
　　 結果： C、D

15、、E、F四組在各檢測時間點愈合指數(shù)均明顯大于A、B兩組(P<0.05),其中E組、F組愈合指數(shù)又明顯大于其它兩治療組(P<0.05)。E組和F組的平均愈合時間分別為17.25±1.29天和17.67±1.25天,也明顯快于其他組別(P<0.05)。但C組與D組之間、E組與F組之間無論愈合指數(shù)還是平均愈合時間均無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結論： HA1077對MSCs修復全層皮膚缺損創(chuàng)面具有促進作用。
　　 第五

16、部分 MSCs治療性應用的初步研究
　　 目的：在皮膚微環(huán)境下,骨髓間充質干細胞具有分化為表皮細胞的潛能。本部分研究將異體MSCs植入慢性皮膚潰瘍病人創(chuàng)面后,觀察能否促進創(chuàng)面愈合。
　　 方法：體外分離人MSCs。慢性皮膚創(chuàng)面病人2例,四個創(chuàng)面,采用同體對照,治療側創(chuàng)面植入所分離MSCs結合常規(guī)換藥治療,對照側單純常規(guī)換藥,觀察14天。計算創(chuàng)面愈合指數(shù)。
　　 結果：病例1,治療側創(chuàng)面14天時愈合指數(shù)為45％,對