鹽霉毒抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及機(jī)理研究.pdf

1、研究背景:
　　 鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤，好發(fā)于中國(guó)華南地區(qū)，每100，000人大約有25-50人發(fā)病。鼻咽癌的發(fā)病同EBV病毒感染，遺傳易感性以及接觸某些化學(xué)致癌物有關(guān)。在過(guò)去的幾十年里，鼻咽癌的診斷和治療手段逐步提高，但Ⅳ期鼻咽癌5年生存率僅有30％，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良。
　　 當(dāng)前越來(lái)越多的證據(jù)顯示腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞(cancerst

2、emcells，CSCs)，它是一類未分化細(xì)胞，具有自我更新、無(wú)限增殖和分化的能力，能促使腫瘤組織形成和無(wú)限生長(zhǎng)，CSCs往往對(duì)化療抵抗并導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，殺傷腫瘤干細(xì)胞對(duì)于成功治療腫瘤至關(guān)重要。
　　 目前分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞主要有如下幾種方式:1.特異性細(xì)胞表面標(biāo)記，細(xì)胞表面蛋白如CD24、CD44、CD133和一些胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物也廣泛應(yīng)用于鑒定腫瘤干細(xì)胞;2.側(cè)群細(xì)胞，利用DNA染料Hoechst33342染料和

3、流式細(xì)胞術(shù)分選，它們依賴ABCG2分子的表達(dá)將DNA特異性染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外，目前已有報(bào)道表明SP可應(yīng)用于鑒別和分選鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞;3.腫瘤球培養(yǎng)，含EGF、bFGF無(wú)血清培養(yǎng)基可以促進(jìn)正常干細(xì)胞的體外擴(kuò)增而不發(fā)生分化，通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)形成腫瘤細(xì)胞球可以用來(lái)富集腫瘤干細(xì)胞;4.PKH26標(biāo)記，一種親脂性的紅色熒光染料，可與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層不可逆結(jié)合，已有報(bào)道PKH26可標(biāo)記靜止期細(xì)胞，可作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記，

4、PKH26陽(yáng)性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞性質(zhì);5.乙醛脫氫酶(ALDH)，已經(jīng)被報(bào)道可用作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，乙醛脫氫酶催化乙醛氧化成羧酸，在生物體內(nèi)外的代謝中扮演著重要角色，已有報(bào)道稱ALDH可作為多種腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)記物。
　　 目前已有許多研究表明腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移同腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，傳統(tǒng)的化療藥物只能殺傷非干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)為超越傳統(tǒng)抗增殖藥物的治療策略的合理性奠定理論基礎(chǔ)。當(dāng)前抑制腫瘤干細(xì)胞的策略主要包括:1.阻斷自我更新

5、信號(hào)通路;2.逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性;3.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化;4.影響調(diào)節(jié)干細(xì)胞的microRAN表達(dá)。有報(bào)道將EMT，腫瘤干細(xì)胞和腫瘤耐藥三者比喻為腫瘤發(fā)生過(guò)程中的邪惡軸心(axisofevil)，三者可互相轉(zhuǎn)化，microRNA在調(diào)節(jié)三者之間關(guān)系中發(fā)揮著最重要的作用。
　　 長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直期望能找到一種能特異性地抑制CSCs的藥物。但是由于CSCs在腫瘤細(xì)胞群中分布之稀少，以及體外培養(yǎng)時(shí)的不穩(wěn)定性，使得尋找這樣一種藥物的目標(biāo)遠(yuǎn)不

6、可及。當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為普通化療藥物只能殺傷占腫瘤絕大部分的非腫瘤干細(xì)胞，而難以殺傷腫瘤干細(xì)胞，只有聯(lián)合使用特異性針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物才有望徹底消除腫瘤。
　　 鹽霉素是一種羧酸聚醚類抗生素，主要用于防止白色鏈霉菌引起的雞球蟲病，當(dāng)前有報(bào)道稱鹽霉素具有抑制腫瘤干細(xì)胞作用，鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞的效力比普通抗癌藥物泰克索高100倍。
　　 本研究以常規(guī)化療藥物順鉑作為對(duì)照，研究了鹽霉素對(duì)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的作用。通過(guò)側(cè)群分析，A

7、ldefluor檢測(cè)以及腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)證明了鹽霉素可以有效抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞。此外，證實(shí)了鹽霉素可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA-200c發(fā)揮其抑制腫瘤干細(xì)胞的作用。本研究為鹽霉素抑制腫瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制提供了重要的結(jié)論。
　　 研究目的:
　　 1.驗(yàn)證鼻咽癌腫瘤球干細(xì)胞特性;
　　 2.檢測(cè)鹽霉素抗鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞效應(yīng);
　　 3.研究鹽霉素抗腫瘤干細(xì)胞分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 細(xì)胞和培養(yǎng)

8、條件:
　　 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。人鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 腫瘤球培養(yǎng)和分化實(shí)驗(yàn):
　　 無(wú)血清培養(yǎng)基配制:無(wú)血清培養(yǎng)基(serumfreemedium，SFM)由Ham’sDMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)組成

9、，將鼻咽癌SUNE-1，5-8F細(xì)胞接種于10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用PBS液清洗，胰酶消化，消化后再用PBS清洗兩次，置于低粘附培養(yǎng)板中，懸浮于SFM中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在SFM中形成腫瘤干細(xì)胞球的過(guò)程，將于SFM中形成的細(xì)胞球重新置于SSM中誘導(dǎo)其分化，48h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 免疫熒光:
　　 吸取SFM中形成的腫瘤球至24孔板中（腫瘤球樣品），或吸取S

10、FM中形成的腫瘤球植入預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中（腫瘤球分化樣品），4％多聚甲醛固定，PBS清洗，0.2％TritonX-100破膜，PBS清洗，加入一抗37℃孵育45min，PBS清洗，洗滌后加入熒光二抗，37℃孵育45min，PBS清洗，DAPI染細(xì)胞核，在共聚焦顯微鏡下觀察。10×KB配方:0.1MTris，pH7.5;1.5MNaCl;1.0％BSA。
　　 MTT檢測(cè):
　　 過(guò)濾網(wǎng)將大于40μm的腫瘤球分離出來(lái)

11、分離成單個(gè)細(xì)胞或?qū)?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞分別接種到96孔板中，每孔2000個(gè)細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，依濃度梯度加入藥物。藥物作用完畢后每孔加20μlMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～5h，將細(xì)胞培養(yǎng)液上清棄去，每孔加入200μlDMSO，搖床混勻約5min。酶標(biāo)儀490nm比色，繪制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 側(cè)群細(xì)胞檢測(cè):
　　 將貼壁細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，離心后用PBS清洗，含2％胎牛血清的1640培基重懸，

12、用Hoechst33342標(biāo)記，標(biāo)記的細(xì)胞在37℃孵育90min，PBS洗滌，重懸，檢測(cè)前加入PropidiumIodide標(biāo)記死細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群比例。
　　 Aldefluor檢測(cè):
　　 將貼壁細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于反應(yīng)緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，測(cè)定管中細(xì)胞懸液總體積1mL，向測(cè)定管中加入激活A(yù)LDH的底物溶液，對(duì)照管中加入ALDH特定抑制物DEAB溶液，取出測(cè)定管中5

13、00μL細(xì)胞懸液加入對(duì)照管中，混勻，將測(cè)定管和對(duì)照管置于37℃孵育40min.離心洗滌后PBS重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 免疫印跡檢測(cè):
　　 蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PVDF膜浸泡在封閉液中25℃2h，一抗4℃孵育過(guò)夜，PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:
　　 細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，待50％細(xì)胞匯合后，用Opti-M

14、EM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，并在室溫孵育10min，在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋miR-200c抑制物及陰性對(duì)照，混合稀釋的miR-200c抑制物/NC和稀釋的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育10min，將混合物加入培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
　　 RNA提取:
　　 細(xì)胞總RNA提取:細(xì)胞消化，離心，棄上清，加入1mlTrizol;室溫孵育15min

15、，裂解細(xì)胞;4℃，12000rpm離心15min，取上清;每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，冰上孵育15min;4℃，12000rpm離心15min，緩慢取上清，避免吸入中間層的白色物質(zhì)，上層水相體積約為所用Trizol試劑的60％;將吸取的上清置于另一干凈EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA，顛倒混勻，4℃，12000rpm離心15min，見(jiàn)RNA沉淀附著于EP管底和側(cè)壁;棄上清，用預(yù)冷的75％乙醇(1

16、％DEPC水配制)1ml懸浮洗滌沉淀;4℃，7500g離心5min，干燥RNA，用DEPC水溶解沉淀，-80℃保存。
　　 免疫組織化學(xué):
　　 石蠟切片經(jīng)脫蠟，乙醇梯度水化，抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗25℃孵育10min，DAB顯色，顯微鏡觀察顯色，蘇木素復(fù)染核，鹽酸乙醇分化，脫水，透明。
　　 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)::
　　 接種時(shí)細(xì)胞用100μl按1:1DMEM和Matrigel

17、懸浮，觀察其成瘤情況如下，記錄小鼠腫瘤發(fā)生的時(shí)間;根據(jù)公式V=1/2ab2（a為長(zhǎng)徑，b為短徑）計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤成長(zhǎng)曲線，腫瘤生長(zhǎng)數(shù)周后處死動(dòng)物取出腫瘤組織。
　　 本課題所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:
　　 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn);腫瘤球形成及直徑，ALDH陽(yáng)性細(xì)胞和側(cè)群比例，凋亡檢測(cè)，動(dòng)物成瘤時(shí)間以及原代細(xì)胞腫瘤球

18、數(shù)量數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組差異，如方差齊性，多重比較采用LSD法;如方差不齊，采用Welch值，多重比較采用DunnettT3法;在體腫瘤生長(zhǎng)曲線的比較采用兩因素方差分析(two-wayANOVA)比較各組間差異。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.培養(yǎng)和鑒定鼻咽癌腫瘤球
　　 (1)免疫熒光和westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示腫瘤球高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物O

19、ct3/4，Bmi-1，Nanog，Sox2，EpCAM和間充質(zhì)標(biāo)記物vimentin，低表達(dá)上皮標(biāo)記物CK5/6;腫瘤球分化后高表達(dá)CK5/6;
　　 (2)單個(gè)PKH26陽(yáng)性的細(xì)胞可形成腫瘤球，PKH26陽(yáng)性細(xì)胞可代表腫瘤干細(xì)胞;免疫熒光結(jié)果顯示腫瘤球有少量細(xì)胞同時(shí)表達(dá)PKH26和干細(xì)胞標(biāo)記So×2，CD133和ABCG2;
　　 (3)腫瘤球細(xì)胞(18.1％，31.9％)ALDH+細(xì)胞比例較分化細(xì)胞(1.0％，1.

20、6％)增高;腫瘤球細(xì)胞(6.1％)SP細(xì)胞比例較分化細(xì)胞(2.3％)增高;
　　 (4)腫瘤球細(xì)胞較分化細(xì)胞增殖速度快;腫瘤球細(xì)胞耐藥性(cisplatin)較分化細(xì)胞強(qiáng)（IC50＞5倍）;
　　 (5)腫瘤球細(xì)胞成瘤能力較分化細(xì)胞強(qiáng)，1×104個(gè)腫瘤球細(xì)胞接種3只裸鼠，2只成瘤，1×104個(gè)分化細(xì)胞接種裸鼠無(wú)腫瘤形成。
　　 2.Salinomycin抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的作用
　　 (1)Salino

21、mycin處理組較未處理組和cisplatin處理組腫瘤球形成率低(P=0.000)，腫瘤球體積小(P=0.000);
　　 (2)腫瘤球細(xì)胞對(duì)salinomycin較cisplatin敏感（IC50＞5倍），分化細(xì)胞對(duì)salinomycin和cisplatin敏感性無(wú)明顯差異;
　　 (3)Cisplatin處理組可增加細(xì)胞SP比例，salinomycin處理組可降低細(xì)胞SP比例;salinomycin抑制腫瘤球ALD

22、H陽(yáng)性細(xì)胞比例（2μM，P=0.005;5μM，P=0.003），cisplatin無(wú)抑制作用(P=0.421);
　　 (4)Salinomycin處理細(xì)胞后c-myc，Oct3/4，Nanog蛋白表達(dá)降低;
　　 (5)Salinomycin抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)較cisplatin作用顯著(P=0.000);salinomycin較cisplatin可顯著推遲腫瘤形成時(shí)間(P=0.011);
　　 (6)Sali

23、nomycin治療組原代細(xì)胞較cisplatin治療組SP比例低(0.9％vs.2.1％)，ALDH陽(yáng)性細(xì)胞比例較低(0.9％vs.8.6％)，成球率低(P=0.000);
　　 (7)Salinomycin治療組動(dòng)物成瘤組織壞死明顯;Salinomycin治療組高表達(dá)E-cadherin，低表達(dá)vimentin和Oct3/4。
　　 3.Salinomycin選擇性抑制腫瘤干細(xì)胞分子機(jī)制研究
　　 (1)Sal

24、inomycin處理組細(xì)胞表達(dá)E-cadherin較高，vimentin，SUZ12和Slug較低;
　　 (2)相對(duì)于CNE-2細(xì)胞，C-666和6-10B細(xì)胞表達(dá)較高ABCG2，相應(yīng)地，C666和6-10B細(xì)胞對(duì)salinomycin較CNE-2細(xì)胞敏感;Salinomycin可抑制ABCG2和p-glycoprotein的表達(dá);
　　 (3)Salinomycin可抑制β-catenin，cyclinD1和P-AK

25、T表達(dá);
　　 (4)隨著salinomycin濃度增加，細(xì)胞凋亡比例逐漸增加(P＜0.05)。
　　 4.Salinomycin通過(guò)調(diào)節(jié)miR-200c抑制腫瘤干細(xì)胞
　　 (1)Salinomycin處理細(xì)胞后提高了miR-200c（＞10倍）;
　　 (2)miR-200c-inhibitor可提高細(xì)胞SP比例和腫瘤球形成能力，miR200c-inhibitor可拮抗salinomycin抑制SP的

26、作用(P=0.013)和抑制腫瘤球形成的能力(P=0.001);
　　 (3)miR-200c-inhibitor可降低細(xì)胞對(duì)cisplatin的敏感性，可增加對(duì)salinomycin的敏感性;
　　 (4)細(xì)胞經(jīng)miR-200c-inhibitor處理可增加干細(xì)胞標(biāo)記物SUZ12和Bmi-1表達(dá)，聯(lián)合salinomycin處理可拮抗miR-200c-inhibitor作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.鼻咽