NF-κB-p65基因在TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 重癥社區(qū)獲得性肺炎(severe community-acquired pneumonia,SCAP)是呼吸內(nèi)科重癥臨護(hù)病房最常見的危重病之一,常導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS),病情進(jìn)展快,處理不及時(shí),可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(multiple system organ dysfunction,MODS)[1]。急性肺損

2、傷(acute lung injury,ALI)是SCAP最常見而嚴(yán)重的病理生理過程,是肺部炎癥致肺泡上皮細(xì)胞受損和肺微血管通透性增加而導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭,其最終階段即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[2]。傳統(tǒng)認(rèn)為,肺泡上皮細(xì)胞是肺部炎癥反應(yīng)的靶細(xì)胞,具有調(diào)節(jié)炎癥發(fā)展及預(yù)后的能力[3]。在細(xì)菌所致肺部急性炎癥反應(yīng)中,革蘭陰性菌細(xì)胞壁的糖脂成分脂多糖(

3、LPS)發(fā)揮了關(guān)鍵作用,LPS可以直接募集血液中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺泡進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等的釋放,通過調(diào)控炎癥通路的活化以及誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子和粘附分子的產(chǎn)生,進(jìn)而造成更嚴(yán)重的肺部損傷[4]。
　　 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下,遵循自身程序,自己結(jié)束生命的過程,對(duì)于機(jī)體穩(wěn)定和生長發(fā)育具有

4、重要的意義[6]。大量研究顯示,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell,AT-Ⅱ)的凋亡在肺部重癥感染所致ALI中起了至關(guān)重要的作用,AT-Ⅱ細(xì)胞的過度凋亡將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)細(xì)胞數(shù)量減少和肺組織病理變化加重；另外在ALI病理變化過程中需將受損的AT-Ⅱ細(xì)胞清除,此過程可能引起炎性反應(yīng)而加重已存在肺組織的損傷,因此肺泡上皮細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)炎癥對(duì)肺損傷的反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用[5]。細(xì)胞凋亡是有一序列酶參與

5、、由基因控制的一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的過程,其中Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過程中起著十分重要的作用[7],根據(jù)作用不同分為兩類:①抑制性亞族,如Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1,可在多個(gè)環(huán)節(jié)上阻斷細(xì)胞凋亡；②促進(jìn)性亞族,如Bax、Bak、Bad、Bik、Bid等,與抑制性亞族結(jié)合而封閉其活性域[8]。
　　 核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是由Sen等[9]從B淋巴細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一

6、種能與免疫球蛋白κ鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的核蛋白因子,因此命名為NF-κB。目前所知NF-κB家族成員包括RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50和p52五個(gè)亞單位。通常NF-κB以p65/p50二聚體形式存在胞漿中,其中p65含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域,在靜息狀態(tài)下,胞漿中的NF-κB與抑制性蛋白IκB-α結(jié)合,不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,當(dāng)細(xì)胞受到如TNF-α等細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí),IκB-α被磷酸化并從NF-κB二聚體上解離下來,p65

7、/p50二聚體立即轉(zhuǎn)移入核,與其靶基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB信號(hào)通路參與了感染、炎癥反應(yīng)和腫瘤等病理過程以及細(xì)胞周期調(diào)控等[10],近年來研究表明,NF-κB家族及其介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞凋亡中起到了重要作用,它參與了多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙向作用[11]。
　　 NF-κB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系最早在腫瘤生長等方面研究,以往研究顯示NF-κB可誘導(dǎo)細(xì)胞表

8、達(dá)TNFR1結(jié)合因子(TFAF)和細(xì)胞凋亡蛋白抑制物,抑制caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而阻斷死亡受體TNFR/Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),而抑制細(xì)胞凋亡[12],所以NF-κB在腫瘤中的主要作用表現(xiàn)為抗凋亡作用。但在SCAP中NF-κB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系卻復(fù)雜得多,是抑制凋亡還是促進(jìn)凋亡?甘前還有爭(zhēng)論。一方面,在多形核中性粒細(xì)胞(PMNs)等炎癥細(xì)胞,NF-κB活化使抗凋亡蛋白合成增加,而使其凋亡延遲,Kupfner J G等[13]在內(nèi)毒

9、素引起的ARDS中發(fā)現(xiàn)NF-κB活化繼而引起A1、A20及Bcl-X的轉(zhuǎn)錄增加,并引起凋亡抑制,在應(yīng)用NF-κB抑制劑后PMNs的凋亡加快；另一方面,對(duì)于肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞,有報(bào)道認(rèn)為,NF-κB調(diào)控失常使促凋亡蛋白如IL-8、TNF、FasL等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng),引起細(xì)胞凋亡的加強(qiáng)[14,15],但其凋亡的調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。
　　 鑒此,本研究擬采用重組的人細(xì)胞因子TNF-α刺激AT-Ⅱ細(xì)胞A549,探討炎癥環(huán)

10、境下肺泡上皮細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控機(jī)制。首先,在TNF-α刺激的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化及凋亡基因Bcl-2、Bax的表達(dá)情況,了解TNF-α對(duì)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響；其次,利用Bax小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默凋亡基因Bax的表達(dá),明確Bax基因與TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系:最后,再利用NF-κB/p65 siRNA沉默NF-κB家族亞單位p65基因的表達(dá),初步探討NF-κB/

11、p65基因在TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制。
　　 方法
　　 1、培養(yǎng)AT-Ⅱ細(xì)胞(來源于人肺泡上皮細(xì)胞株A549),在細(xì)胞密度為80％～90％時(shí)采用低濃度(10ng/ml)的TNF-α刺激A549細(xì)胞,分別在刺激細(xì)胞0h、6h、12h、24和48h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA,Western blotti

12、ng和免疫組化檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)；
　　 2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將Bax siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞,6h后給予TNF-α(10ng/ml)刺激24h收集細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分4組:空白對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+Bax siRNA組(干擾組)、TNF-α+scramble siRNA組(陰性對(duì)照組)。RT-PCR檢測(cè)Bax mRNA,Western blotting和免疫組化檢測(cè)

13、Bax蛋白表達(dá),流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；
　　 3、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將NF-κB/p65 siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞,6h后給予TNF-α(10ng/ml)刺激24h收集細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分4組:空白對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+NF-κB/p65 siRNA組(干擾組)、TNF-α+scramble siRNA組(陰性對(duì)照組)。RT-PCR檢測(cè)NF-κB

14、/p65、Bcl-2、Bax mRNA,免疫組化檢測(cè)NF-κB/p65的活化,Western blotting檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá),流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)論
　　 本研究發(fā)現(xiàn):
　　 1、低濃度(10ng/ml)TNF-α通過上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2表達(dá)比例誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞(A549)凋亡；
　　 2、Bax基因沉默能明顯減少TNF-α誘

15、導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；
　　 3、NF-κB/p65基因沉默能明顯減少TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2表達(dá)比例從而減少A549細(xì)胞凋亡；
　　 4、NF-κB家族亞單位p65的活化參與了肺泡上皮細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),提示NF-κB/p65基因在炎癥細(xì)胞因子如TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡中起了重要作用。調(diào)控NF-κB活性,減少肺泡上皮細(xì)胞過度凋亡,可能成為治療炎癥失衡所致急性