NF-κB-p65基因在TNF-α誘導肺泡上皮細胞凋亡中的作用及可能機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 重癥社區(qū)獲得性肺炎(severe community-acquired pneumonia,SCAP)是呼吸內科重癥臨護病房最常見的危重病之一,常導致全身炎癥反應綜合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS),病情進展快,處理不及時,可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(multiple system organ dysfunction,MODS)[1]。急性肺損

2、傷(acute lung injury,ALI)是SCAP最常見而嚴重的病理生理過程,是肺部炎癥致肺泡上皮細胞受損和肺微血管通透性增加而導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭,其最終階段即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[2]。傳統(tǒng)認為,肺泡上皮細胞是肺部炎癥反應的靶細胞,具有調節(jié)炎癥發(fā)展及預后的能力[3]。在細菌所致肺部急性炎癥反應中,革蘭陰性菌細胞壁的糖脂成分脂多糖(

3、LPS)發(fā)揮了關鍵作用,LPS可以直接募集血液中性粒細胞進入肺泡進而促進細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等的釋放,通過調控炎癥通路的活化以及誘導其它細胞因子和粘附分子的產生,進而造成更嚴重的肺部損傷[4]。
　　 細胞凋亡是細胞在一定生理或病理條件下,遵循自身程序,自己結束生命的過程,對于機體穩(wěn)定和生長發(fā)育具有

4、重要的意義[6]。大量研究顯示,肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell,AT-Ⅱ)的凋亡在肺部重癥感染所致ALI中起了至關重要的作用,AT-Ⅱ細胞的過度凋亡將導致結構細胞數量減少和肺組織病理變化加重；另外在ALI病理變化過程中需將受損的AT-Ⅱ細胞清除,此過程可能引起炎性反應而加重已存在肺組織的損傷,因此肺泡上皮細胞凋亡在調節(jié)炎癥對肺損傷的反應方面發(fā)揮著重要的作用[5]。細胞凋亡是有一序列酶參與

5、、由基因控制的一個主動的、高度有序的過程,其中Bcl-2家族成員在細胞凋亡的基因調控過程中起著十分重要的作用[7],根據作用不同分為兩類:①抑制性亞族,如Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1,可在多個環(huán)節(jié)上阻斷細胞凋亡；②促進性亞族,如Bax、Bak、Bad、Bik、Bid等,與抑制性亞族結合而封閉其活性域[8]。
　　 核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是由Sen等[9]從B淋巴細胞核提取物中發(fā)現的一

6、種能與免疫球蛋白κ鏈基因增強子κB序列特異結合的核蛋白因子,因此命名為NF-κB。目前所知NF-κB家族成員包括RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50和p52五個亞單位。通常NF-κB以p65/p50二聚體形式存在胞漿中,其中p65含有轉錄活化區(qū)域,在靜息狀態(tài)下,胞漿中的NF-κB與抑制性蛋白IκB-α結合,不能發(fā)揮轉錄調節(jié)作用,當細胞受到如TNF-α等細胞外信號刺激時,IκB-α被磷酸化并從NF-κB二聚體上解離下來,p65

7、/p50二聚體立即轉移入核,與其靶基因啟動子/增強子上的κB位點結合,啟動相關基因的轉錄。NF-κB信號通路參與了感染、炎癥反應和腫瘤等病理過程以及細胞周期調控等[10],近年來研究表明,NF-κB家族及其介導的細胞信號轉導在細胞凋亡中起到了重要作用,它參與了多種凋亡相關基因的轉錄調控,具有抑制細胞凋亡和促進細胞凋亡的雙向作用[11]。
　　 NF-κB與細胞凋亡的關系最早在腫瘤生長等方面研究,以往研究顯示NF-κB可誘導細胞表

8、達TNFR1結合因子(TFAF)和細胞凋亡蛋白抑制物,抑制caspase的級聯(lián)反應,從而阻斷死亡受體TNFR/Fas介導的凋亡信號轉導,而抑制細胞凋亡[12],所以NF-κB在腫瘤中的主要作用表現為抗凋亡作用。但在SCAP中NF-κB與細胞凋亡的關系卻復雜得多,是抑制凋亡還是促進凋亡?甘前還有爭論。一方面,在多形核中性粒細胞(PMNs)等炎癥細胞,NF-κB活化使抗凋亡蛋白合成增加,而使其凋亡延遲,Kupfner J G等[13]在內毒

9、素引起的ARDS中發(fā)現NF-κB活化繼而引起A1、A20及Bcl-X的轉錄增加,并引起凋亡抑制,在應用NF-κB抑制劑后PMNs的凋亡加快；另一方面,對于肺泡上皮細胞和內皮細胞等肺結構細胞,有報道認為,NF-κB調控失常使促凋亡蛋白如IL-8、TNF、FasL等的轉錄表達增強,引起細胞凋亡的加強[14,15],但其凋亡的調控機制還不是很清楚。
　　 鑒此,本研究擬采用重組的人細胞因子TNF-α刺激AT-Ⅱ細胞A549,探討炎癥環(huán)

10、境下肺泡上皮細胞凋亡的基因調控機制。首先,在TNF-α刺激的不同時間點檢測細胞凋亡率的變化及凋亡基因Bcl-2、Bax的表達情況,了解TNF-α對肺泡上皮細胞凋亡的影響；其次,利用Bax小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默凋亡基因Bax的表達,明確Bax基因與TNF-α誘導肺泡上皮細胞凋亡的關系:最后,再利用NF-κB/p65 siRNA沉默NF-κB家族亞單位p65基因的表達,初步探討NF-κB/

11、p65基因在TNF-α誘導肺泡上皮細胞凋亡中的作用及可能機制。
　　 方法
　　 1、培養(yǎng)AT-Ⅱ細胞(來源于人肺泡上皮細胞株A549),在細胞密度為80％～90％時采用低濃度(10ng/ml)的TNF-α刺激A549細胞,分別在刺激細胞0h、6h、12h、24和48h五個時間點收集細胞,流式細胞儀(Annexin V-FITC法)檢測細胞凋亡率,RT-PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA,Western blotti

12、ng和免疫組化檢測Bcl-2和Bax蛋白表達；
　　 2、利用脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000將Bax siRNA轉染入A549細胞,6h后給予TNF-α(10ng/ml)刺激24h收集細胞,實驗分4組:空白對照組、TNF-α組、TNF-α+Bax siRNA組(干擾組)、TNF-α+scramble siRNA組(陰性對照組)。RT-PCR檢測Bax mRNA,Western blotting和免疫組化檢測

13、Bax蛋白表達,流式細胞儀(Annexin V-FITC法)檢測細胞凋亡率；
　　 3、利用脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000將NF-κB/p65 siRNA轉染入A549細胞,6h后給予TNF-α(10ng/ml)刺激24h收集細胞,實驗分4組:空白對照組、TNF-α組、TNF-α+NF-κB/p65 siRNA組(干擾組)、TNF-α+scramble siRNA組(陰性對照組)。RT-PCR檢測NF-κB

14、/p65、Bcl-2、Bax mRNA,免疫組化檢測NF-κB/p65的活化,Western blotting檢測Bcl-2、Bax蛋白表達,流式細胞儀(Annexin V-FITC法)檢測細胞凋亡率。
　　 結論
　　 本研究發(fā)現:
　　 1、低濃度(10ng/ml)TNF-α通過上調凋亡相關基因Bax/Bcl-2表達比例誘導AT-Ⅱ細胞(A549)凋亡；
　　 2、Bax基因沉默能明顯減少TNF-α誘

15、導A549細胞凋亡；
　　 3、NF-κB/p65基因沉默能明顯減少TNF-α誘導A549細胞凋亡,其機制可能是通過下調凋亡相關基因Bax/Bcl-2表達比例從而減少A549細胞凋亡；
　　 4、NF-κB家族亞單位p65的活化參與了肺泡上皮細胞凋亡信號轉導,提示NF-κB/p65基因在炎癥細胞因子如TNF-α誘導的肺泡上皮細胞凋亡中起了重要作用。調控NF-κB活性,減少肺泡上皮細胞過度凋亡,可能成為治療炎癥失衡所致急性