神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)哮喘小鼠肺組織γ-氨基丁酸A受體表達(dá)及氣道黏液分泌的影響.pdf

1、背景及目的：
　　 支氣管哮喘是由多種細(xì)胞、細(xì)胞組分和神經(jīng)遞質(zhì)參與的氣道慢性的炎癥性疾病。近些年來(lái)，哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)哮喘防治的研究一直是各國(guó)醫(yī)學(xué)工作者探討的熱點(diǎn)。目前，許多研究都表明免疫機(jī)制占有重要作用，近年來(lái)，神經(jīng)源性因素在哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要作用也日益受到重視。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor，NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員之一，是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，NGF能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，是種多功能的

2、因子，除了對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用以外，還參與了復(fù)雜的免疫-神經(jīng)相互作用，是免疫可塑性和神經(jīng)可塑性的雙重的調(diào)節(jié)因子。研究表明，NGF參與了多種疾病的發(fā)生，如潰瘍性結(jié)腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性神經(jīng)炎、過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘等，提示NGF在哮喘發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義，但其具體作用的機(jī)制則需進(jìn)一步研究。
　　 GABA是成年哺乳動(dòng)物大腦中的主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)合成

3、酶(GAD)和A型GABA受體(GABAAR)在人類(lèi)和鼠肺的氣道上皮細(xì)胞表達(dá)，GABAAR由5個(gè)亞基所構(gòu)成，門(mén)控氯離子通道是由其的中心部位所形成，在GABAAR復(fù)合物的組裝和功能中α亞單位對(duì)起著主要作用。氣道黏液高分泌是哮喘特征之一，主要是由氣道杯狀細(xì)胞表達(dá)的黏蛋白上調(diào)的結(jié)果。MUC5AC是氣道主要的黏蛋白，它的表達(dá)受氣道上皮細(xì)胞的GABAAR的調(diào)控。
　　 本實(shí)驗(yàn)中，我們建立小鼠模型，研究探討NGF在氣道黏液分泌中的作用，研究

4、哮喘小鼠哮喘模型的肺組織中的GABAARα、MUC5AC的表達(dá)水平及在NGF抗體干預(yù)后的改變，了解NGF、GABAARα、MUC5AC之間的關(guān)系。本研究旨在進(jìn)一步探討NGF在哮喘氣道黏液分泌中的具體作用及機(jī)制，并為哮喘的早期干預(yù)治療提供理論依據(jù)。
　　 材料方法：
　　 6周齡清潔級(jí)雌性BALB/C小鼠30只，被隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、哮喘組和NGF阻斷組，每組10只。實(shí)驗(yàn)的第1天、第8天，哮喘組小鼠腹腔注射(OVA)/A

5、l(OH)3(含Al(OH)3100mg和OVA1mg)1mL的混合液進(jìn)行致敏，第15天起，每天以2％OVA超聲霧化30分鐘激發(fā)，連續(xù)進(jìn)行7天。對(duì)照組的致敏和激發(fā)都使用生理鹽水來(lái)代替。NGF阻斷組哮喘模型的建立同哮喘組，但是在每次OVA超聲霧化前的3h，先通過(guò)鼻滴抗小鼠β-NGF抗體50μl(稀釋度1∶50)。末次激發(fā)后24h后，腹腔注射用10％的水合氯醛(20mg/kg)來(lái)麻醉小鼠，暴露胸腔，在左主支氣管處將左肺結(jié)扎，后氣管插管，生理

6、鹽水來(lái)灌洗小鼠的右肺，取肺泡灌洗液(BALF)，離心后細(xì)胞沉渣用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。取留左肺，其上葉使用4％的多聚甲醛用來(lái)固定，然后常規(guī)用石蠟包埋，切片備用，迅速將左肺下葉放入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。肺組織的切片進(jìn)行HE染色來(lái)觀察氣道病理改變;免疫組化法檢測(cè)肺組織中MUC5AC、GABAARa蛋白的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)肺組織中MUC5AC、GABAARamRNA的表達(dá)水平;用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

7、分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般癥狀:哮喘組小鼠在激發(fā)過(guò)程中出現(xiàn)安靜少動(dòng)，弓背直立，打噴嚏，點(diǎn)頭樣喘息，大小便失禁等哮喘急性發(fā)作表現(xiàn):NGF阻斷組與哮喘組相比，上述癥狀較稍輕;對(duì)照組無(wú)明顯的喘息癥狀。
　　 2.BALF細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)數(shù):哮喘組小鼠的BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的比率均比對(duì)照組顯著增多（P均＜0.05），NGF阻斷組的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)

8、胞的比率均比哮喘組降低（P均＜0.05)。
　　 3.肺組織病理觀察:哮喘組小鼠支氣管上皮細(xì)胞脫落，管壁、血管壁周?chē)醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔變寬，肺泡腔內(nèi)有炎性滲出物;NGF阻斷組上述病變均較哮喘組減輕;對(duì)照組小鼠氣道上皮細(xì)胞完整，血管及氣管周?chē)鷽](méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 4.肺組織中GABAARα、MUC5AC蛋白的表達(dá)情況:哮喘組小鼠的肺組織中GABAARα、MUC5AC蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組高（P均＜0.05），NGF

9、阻斷組較哮喘組降低，但仍高于對(duì)照組（P均＜0.05）。
　　 5.肺組織中GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA的表達(dá)情況:RT-RCR結(jié)果顯示，哮喘組小鼠的肺組織GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA表達(dá)量均較對(duì)照組高（P均＜0.05），NGF阻斷組較哮喘組降低，但仍高于對(duì)照組（P均＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.小鼠急性哮喘模型肺組織中GABAARα、MUC5AC表達(dá)量增加，提示GABAA