miR-26a-26b靶向調(diào)控唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST8SIA4在乳腺癌增殖及侵襲中的作用.pdf

1、乳腺癌是女性易發(fā)的惡性腫瘤之一，也是造成女性死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年世界范圍內(nèi)新發(fā)病例大約170萬，而其中死亡病例就已接近50萬[1]。來自中國抗癌協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示，目前我國乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的速度遞增，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢，而且逐漸成為城市中死亡率增長最快的癌癥。因此，為降低乳腺癌患者的死亡率，不僅僅是要早期治療，更重要的是有效防止其惡性進(jìn)展。
　　乳腺癌是起源于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，原位乳腺癌并不致命，如果

2、能夠做到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療，乳腺癌或可成為療效最佳的實(shí)體腫瘤之一。但乳腺癌的早期癥狀往往并不明顯，這就使很多患者錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，乳腺癌細(xì)胞一旦脫離原發(fā)病灶，極易通過血液或淋巴液進(jìn)行播散，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響乳腺癌患者的生存質(zhì)量和生存率。
　　糖鏈與細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)相連，幾乎覆蓋細(xì)胞膜的整個(gè)外表面[2]，它決定了細(xì)胞的“面部特征”。唾液酸化修飾是以單磷酸胞苷活化的唾液酸（CMP-Neu5Ac）為底物，經(jīng)唾液酸糖基轉(zhuǎn)

3、移酶（sialyltransferase，ST）催化，將底物中的唾液酸殘基（Neu5Ac）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜糖蛋白或糖脂末端的過程。唾液酸殘基（Neu5Ac）以糖苷鍵連接到糖蛋白或糖脂的糖鏈末端，根據(jù)形成的糖苷鍵類型的不同，可以將唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶家族分成四大類，共20種亞型。第一類，以α-2,3糖苷鍵將唾液酸殘基連接到糖鏈末端的半乳糖上，共6種亞型，包括ST3Gal1-6；第二類，以α-2,6糖苷鍵將唾液酸殘基連接到糖鏈末端的半乳糖上，共2種

4、亞型，包括ST6Gal1-2；第三類，以α-2,6糖苷鍵將唾液酸殘基連接到糖鏈末端的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）上，共6種亞型，包括ST6GalNAc1-6；第四類，以α-2,8糖苷鍵將唾液酸殘基連接到其他唾液酸（Sia）上，共6種亞型，包括ST8SIA1-6[3]。唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)和功能的改變可以直接影響細(xì)胞膜糖蛋白和糖脂的唾液酸化糖基化的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　唾液酸化修飾是蛋白質(zhì)糖基化的一種。細(xì)胞

5、表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修飾廣泛存在，并且在細(xì)胞粘附、抗原識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)等[4]多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。而唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)及活性的改變，可以直接影響糖鏈的結(jié)構(gòu)和功能。而糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的改變往往與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。隨著對(duì)腫瘤分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，唾液酸化修飾與惡性腫瘤在其增殖、遷移和侵襲以及逃避機(jī)體免疫監(jiān)視等方面都具有十分重要的作用，唾液酸化修飾的糖鏈被認(rèn)為是一種新型的、

6、廣譜的腫瘤標(biāo)志物[5]。
　　大量研究表明，唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。如：ST3GAL2的過表達(dá)與乳腺癌病人臨床化療療效密切相關(guān)[6]。下調(diào)ST6GAL1的表達(dá)，可抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[7]。ST6GALNAC1的過表達(dá)，可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的成瘤性[8]。ST6GALNAC5在乳腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)，可增強(qiáng)其對(duì)大腦內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而誘發(fā)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[9]。ST8SIA1在雌激素受體陰性乳腺癌的不同

7、亞型中呈現(xiàn)高表達(dá)[10]。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度大約為19-24個(gè)核苷酸的、單鏈非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，其基因序列高度保守，在細(xì)胞內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)控。miRNAs通過與靶基因mRNA完全性或不完全性的互補(bǔ)結(jié)合，使靶基因mRNA斷裂降解或抑制其翻譯，從而達(dá)到調(diào)控靶基因表達(dá)的目的。miRNAs的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中同樣扮演著關(guān)鍵性的角色。有研究證實(shí)，miR-147，miR-340

8、和 miR-1296的異常表達(dá)可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移[11-13]；miR-139-5p能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，而miR-217的過表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力[14]。
　　近來發(fā)現(xiàn)，miR-26家族由4個(gè)序列相似、結(jié)構(gòu)相仿、種子區(qū)序列（UCAAUGA）相同的miRNAs組成，該家族成員主要有miR-26a，miR-26b，miR-1297和miR-4465。包括乳腺癌、肝癌、胃癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤，與相應(yīng)的癌

9、旁組織相比，均可見miR-26a/b低表達(dá)，并且與腫瘤的預(yù)后、療效、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期等都存在一定的相關(guān)性[15]。然而，關(guān)于miR-26a/b是否存在對(duì)唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA的靶向調(diào)控作用，以及該靶向調(diào)控作用如何影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　本研究中，通過分析乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞株膜蛋白唾液酸化N-糖鏈的組成，揭示了唾液酸化與乳腺癌進(jìn)展的相關(guān)性，同時(shí)也提供了miRNA調(diào)控唾液酸化的新證據(jù)。質(zhì)譜分析表明

10、，與癌旁組織及正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A相比，在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，膜蛋白N-糖鏈的唾液酸化水平顯著增高。我們對(duì)20種唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和癌旁組織中存在顯著性差異；在具有不同轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7，和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A間同樣存在顯著性差異。其中ST8SIA4在乳腺癌組織以及具有高度轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中明顯高表達(dá)。

11、敲除乳腺癌細(xì)胞的ST8SIA4可以明顯抑制其惡性行為，尤其是可以抑制唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶依賴性的細(xì)胞增殖和侵襲。通過生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì) miRNA的靶點(diǎn)ST8SIA43'-UTR端進(jìn)行預(yù)測，可以確定ST8SIA4是miR-26a/26b的靶基因之一。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在乳腺癌細(xì)胞株、乳腺癌組織及癌旁組織中，ST8SIA4和miR-26a/26b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過雙熒光素酶報(bào)告分析方法可以發(fā)現(xiàn)，miR-26a/26b通過與ST8SIA4

12、的3'-UTR的特異性結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。我們通過轉(zhuǎn)染miR-26a/26b模擬物或抑制物來改變?nèi)橄侔┘?xì)胞ST8SIA4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-26a/26b可以降低乳腺癌細(xì)胞ST8SIA4的表達(dá)水平并且可以影響乳腺癌進(jìn)展。這些結(jié)果顯示，唾液酸糖基化水平的改變可以作為乳腺癌進(jìn)展的有效標(biāo)志，此外，miR-26a/26b可以通過靶向作用ST8SIA4廣泛參與對(duì)唾液酸糖基化機(jī)制的調(diào)控。
　　第一部分質(zhì)譜分析乳腺癌組織和細(xì)胞株表面N-糖

13、鏈的組成差異
　　目的：
　　通過質(zhì)譜分析乳腺癌組織、癌旁組織、乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231）、人乳腺上皮細(xì)胞株（MCF-10A）細(xì)胞表面N-糖鏈的組成，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的N-糖鏈以及唾液酸化的N-糖鏈。
　　方法：
　　提取組織和細(xì)胞株的膜蛋白，并制備甲基化N-糖鏈。使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀，應(yīng)用FlexControl3.4軟件系統(tǒng)（Bruker-Daltonics，Germany）分析乳腺癌組織與癌旁組

14、織、MDA-MB-231與MCF-10A之間膜蛋白N-糖鏈的差異。
　　結(jié)果：
　　（1）在乳腺癌組織和癌旁組織中共有32種N-糖鏈的表達(dá)，信號(hào)峰3,5,6,7,11,12,14,15,16,28,35和36只在乳腺癌組織中表達(dá)，其中信號(hào)峰35為唾液酸化N-糖鏈（Figure1B，Table4）。另外，與癌旁組織相比，信號(hào)峰13,17,18,23,32和33在乳腺癌組織中見顯著增強(qiáng)（>2 fold），其中23和32為唾液酸化

15、N-糖鏈（Figure1B，Table4）。
　?。?）在MDA-MB-231和MCF-10A中共有33種N-糖鏈的表達(dá)，信號(hào)峰22,29,37和40只在MDA-MB-231特異性地表達(dá)，且和唾液酸化密切相關(guān)。除此之外，與MCF-10A相比，信號(hào)峰1,4,5,10,11,15,16,18,21,25,26,27,31,32,33,34,35,38和39（>2 folds）在MDA-MB-231中顯著增強(qiáng)（Figure2B），其中信

16、號(hào)峰25,27,32,33,34,35,38和39與唾液酸化密切相關(guān)（Table4）。
　　結(jié)論：
　?。?）乳腺癌組織和癌旁組織的膜蛋白N-糖鏈的組成存在明顯差異，且差異表達(dá)的N-糖鏈與唾液酸化密切相關(guān)。
　?。?） MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞膜蛋白N-糖鏈的組成存在明顯差異，且差異表達(dá)的N-糖鏈與唾液酸化密切相關(guān)。
　　（3）以上結(jié)論表明，唾液酸化的N-糖鏈異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)展密切相關(guān)。

17、>　　第二部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測組織和細(xì)胞株唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶(ST)基因mRNA的表達(dá)及ST8SIA4在組織及細(xì)胞株中蛋白的表達(dá)
　　目的：
　　通過檢測乳腺癌組織與癌旁組織、乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231、MCF-7）與人乳腺上皮細(xì)胞株（MCF-10A）ST基因家族mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)明顯的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　方法：
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)篩選出MDA-MB-231、MCF-7及MC

18、F-10A間，乳腺癌組織及癌旁組織間差異表達(dá)明顯的ST基因；并通過免疫組織化學(xué)染色和western-blot技術(shù)對(duì)篩選出的差異表達(dá)ST進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　?。?） ST6GALNAC5(2.31 folds)，ST8SIA3(1.78 folds)和ST8SIA4(2.47 folds) mRNA在乳腺癌組織中高表達(dá)(Figure3B，C)。
　　（2）與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，ST6GALNAC5(

19、7.33 folds)，ST8SIA4(14.81 folds)和ST8SIA5(3.11 folds) mRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高(Figure4B，C)；與侵襲性較弱的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7相比，ST3GAL6(12.34 folds)和 ST8SIA4(5.71 folds) mRNA在 MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)(Figure4A，C)。
　?。?）免疫組織化學(xué)染色顯示，與癌旁組織相比

20、，ST8SIA4在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)（Figure5A）。免疫熒光染色顯示，與 MCF-7相比，ST8SIA4在MDA-MB-231細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)（Figure5A）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示，與低轉(zhuǎn)移潛能MCF-7細(xì)胞相比，ST8SIA4蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)（Figure5B）。
　　結(jié)論：
　　ST8SIA4在MDA-MB-231中表達(dá)明顯升高，在MCF-7和MCF-

21、10A中輕度表達(dá)，其差異表達(dá)最為顯著。ST8SIA4在乳腺癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)最為明顯。這表明，唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST8SIA4可能與乳腺癌的惡性進(jìn)展相關(guān)。
　　第三部分特異性下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中的ST8SIA4的表達(dá)，觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外的增殖和侵襲能力、體內(nèi)成瘤性的影響
　　目的：
　　特異性下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中高表達(dá)的ST8SIA4，檢測ST8SIA4下調(diào)后的MDA-MB-231細(xì)胞在體

22、外增殖和侵襲能力以及在小鼠體內(nèi)成瘤能力的變化。
　　方法：
　　沉默MDA-MB-231細(xì)胞中的ST8SIA4基因后，采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、transwell試驗(yàn)及體內(nèi)成瘤試驗(yàn)，檢測其體外增殖能力和侵襲能力以及體內(nèi)成瘤能力的變化。
　　結(jié)果：
　?。?）與轉(zhuǎn)染control shRNA相比，轉(zhuǎn)染ST8SIA4 shRNA的MDA-MB-231細(xì)胞中的ST8SIA4的蛋白水平明顯降低，且具有顯著性差

23、異（Figure6，*P<0.05）。
　?。?）CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默ST8SIA4基因的MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖受到明顯抑制(Figure7)。劃痕試驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，特異性下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中的ST8SIA4后，細(xì)胞體外遷移、侵襲能力均明顯下降（Figure8A，B）。
　　（3）體內(nèi)成瘤試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，注射ST8SIA4 shRNA細(xì)胞的小鼠成

24、瘤體積明顯減小（Figure9，*P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　特異性下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中ST8SIA4后，該細(xì)胞體外增殖受抑、侵襲能力明顯下降。小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)中，平均成瘤體積明顯低于對(duì)照組。
　　第四部分 miR-26a和miR-26b對(duì)ST8SIA4靶向調(diào)控作用
　　目的：
　　通過檢測組織和細(xì)胞株中miR-26a/26b的表達(dá)，分析其與ST8SIA4表達(dá)的潛在相關(guān)性。
　　方法：

25、
　　定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析乳腺癌組織及癌旁組織中，MDA-MB-231、MCF-7及MCF-10A的miR-26a和miR-26b的表達(dá)情況。采用qRT-PCR分析乳腺癌組織、癌旁組織的ST8SIA4 mRNA與miR-26a/26b表達(dá)水平及相關(guān)性。特異性上調(diào)MDA-MB-231中的miR-26a/26b、下調(diào)MCF-7中的miR-26a/26b，檢測過表達(dá)、干擾前后，細(xì)胞中ST8SIA4的mRNA及其蛋白

26、表達(dá)情況。采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-26a/26b對(duì)ST8SIA4的靶向調(diào)控功能。
　　結(jié)果：
　?。?）qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miR-26a/26b的表達(dá)水平明顯下降（Figure10A）。與MCF-7和MCF-10A相比，MDA-MB-231細(xì)胞的miR-26a/26b表達(dá)水平明顯下降（Figure10B）。且在乳腺癌組織和癌旁組織中，ST8SIA4 mRNA的表達(dá)水平與miR-26a/

27、26b的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（Figure11），在乳腺癌細(xì)胞株中的表現(xiàn)亦如此。
　?。?）特異性上調(diào)MDA-MB-231中的miR-26a/26b的后，ST8SIA4的mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯下降（Figure12A，B）。特異性下調(diào)MCF-7中的miR-26a/26b的后，ST8SIA4的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高（Figure12C，D）。
　　（3）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ST8SIA4WT

28、3’-UTR+ miR-26a/26b mimic組熒光素酶活性顯著降低，而 ST8SIA4MUT3’-UTR+miR-26a/26b mimic組熒光素酶活性沒有明顯變化（Figure13）。
　　結(jié)論：
　　ST8SIA4為miR-26a和miR-26b的靶基因。miR-26a和miR-26b通過與ST8SIA4的3′UTR結(jié)合，靶向調(diào)控ST8SIA4，使其表達(dá)水平下調(diào)。
　　第五部分 miR-26a/26b靶向調(diào)

29、控 ST8SIA4的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響
　　目的：
　　通過特異性上調(diào)及下調(diào)miR-26a/26b在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231及MCF-7中的表達(dá)，觀察過表達(dá)、干擾前后，miR-26a/26b對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖和侵襲能力的影響；調(diào)控ST8SIA4的表達(dá)，分析miR-26a/26b對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：
　　將miR-26a/26b mimic和miR-26a/

30、26b inhibitor分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞后，特異性上調(diào)MDA-MB-231中的miR-26a/26b、下調(diào)MCF-7中的miR-26a/26b表達(dá)，采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)，檢測過表達(dá)、干擾前后，乳腺癌細(xì)胞體外增殖能力和侵襲能力變化。
　　結(jié)果：
　?。?）與轉(zhuǎn)染NC mimic相比，特異性上調(diào)MDA-MB-231中的miR-26a/26b后，免疫熒光結(jié)果顯

31、示，ST8SIA4表達(dá)明顯減低（Figure15A）。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖能力明顯下降（Figure16）；劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯下降（Figure17A，B）。其次，ST8SIA4的過表達(dá)能夠明顯的逆轉(zhuǎn)miR-26a/26b對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制（Figure19）。
　　(2)與轉(zhuǎn)染NC inhibitor相比，特異性下調(diào)MCF-7中的miR-26a/26b后，免疫熒光結(jié)果顯

32、示，ST8SIA4表達(dá)明顯增強(qiáng)（Figure21A，B）。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其細(xì)胞增殖能力明顯提高（Figure22）；劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)（Figure23A）。其次，ST8SIA4的敲除能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-26a/26b inhibitor對(duì)細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用（Figure25）。
　　結(jié)論：
　?。?）過表達(dá)miR-26a/26b能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的増殖、遷