高胰島素抑制腎臟尿酸排泄的基礎與臨床研究以及氯沙坦的干預機制.pdf

1、研究背景：近年來，代謝綜合征（Me tS）的發(fā)生率在我國逐年增高，因其與心血管疾病、糖尿病和腎臟疾病的發(fā)生率及死亡率密切相關，目前已成為重要的公共衛(wèi)生健康問題。MetS常伴有較高的高尿酸血癥發(fā)生率，作為MetS基本病理生理特征的高胰島素血癥及/或胰島素抵抗（IR）被認為是導致血尿酸水平的升高或高尿酸血癥發(fā)生的主要原因，而腎臟尿酸排泄下降在血尿酸升高中發(fā)揮重要作用。在腎臟中，位于近端腎小管上皮細胞管腔膜和基底外側膜上的轉運蛋白是腎臟轉運尿

2、酸的分子基礎，其中尿酸轉運蛋白-1(URAT1，SLC22A12基因編碼)在人體中主要負責尿酸的重吸收，它在維持血尿酸穩(wěn)定方面扮演重要角色。血尿酸水平的升高或高尿酸血癥既是心血管疾病以及腎臟病發(fā)生的高危因素，還可以導致代謝綜合征相關組分——肥胖、血脂異常和高血壓等的發(fā)生率增高，甚至可被看作是MetS的組分之一。因此對代謝綜合征患者伴發(fā)無癥狀性的血尿酸升高進行干預是十分必要的，有大量證據表明，在高尿酸血癥患者中積極控制血尿酸水平對減少心血

3、管事件的發(fā)生、保護腎臟功能具有非常有益的作用。目前有關降低血尿酸或促進尿酸排泄的藥物因其副作用較大，其臨床應用也受到諸多限制。氯沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類降壓藥，人們發(fā)現它除了能有效控制患者血壓、減少心血管并發(fā)癥、減少尿蛋白及保護腎臟功能外，還可以降低正常人和高血壓患者的血尿酸?？傊?，高胰島素血癥是否可以促進腎臟尿酸排泄、是否經胰島素信號通路誘導腎小管上皮細胞表達UR AT1導致血尿酸升高以及具有促進尿酸排泄作用的——氯沙

4、坦是否對這一過程有影響，目前作用機制尚不明確，有必要進一步探討。
　　目的：本論文擬從臨床橫斷面分析來觀察MetS患者血胰島素與腎臟尿酸排泄之間的關系，從體外實驗進一步證實高胰島素對 HK-2細胞 U RA T1表達及PI3K/Akt1信號通路的影響，并探討氯沙坦對高胰島素誘導的HK-2細胞URAT1表達及PI3K/Ak t1信號通路的干預作用，為MetS伴發(fā)高尿酸血癥的發(fā)生機制及其防治提供依據。
　　方法：1.選取2014

5、年3月～2015年3月在我院內分泌科就診的MetS患者作為研究對象，進行橫斷面觀察。共入選患者108例，其中男性74例，女性34例，平均年齡54.58（55.31±10.68）歲。收集患者基本資料，檢測血液各相關生化指標；測定血清空腹胰島素（FIns）、餐后2h胰島素（2h PIns）。收集患者24小時尿液，計算腎臟對尿酸排泄相關指標：尿酸排泄分數（FEUA，％）、尿酸清除率（CUA，ml/min/1.73 m2）、單位腎小球濾過尿酸排

6、泄（EurGF，mg/dl/1.73 m2）以及尿尿酸/尿肌酐比值（UUA/Ucr）等；根據中國改良的腎病膳食改良試驗（MDRD）方程估算腎小球濾過率（eGFR）。對不同性別的MetS患者之間一般資料、血和尿生化指標以及腎功能相關指標比較；分別將空腹血胰島素、餐后血胰島素、HOMA-IR等變量由小到大按照四分位數劃分為四組，比較血胰島素和HOMA-IR等指標不同組別之間的尿酸排泄各指標有無差異；依據MetS等診斷標準，將患者按照性別、不

7、同年齡組、腰圍、血壓、血糖、血脂、腎小球濾過率、尿蛋白/微量白蛋白、有無糖尿病及高血壓病史等指標作為可能的影響因素進行單因素分析，比較不同組間MetS患者尿酸排泄指標的差異；對 MetS患者尿酸排泄指標相關影響因素進行多元回歸分析。2.用不同濃度胰島素刺激人腎小管上皮細胞（HK-2），采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測URAT1在HK-2細胞中的表達情況，從蛋白和核酸水平深入研

8、究不同濃度胰島素對UR A T1表達的影響；用高濃度胰島素刺激HK-2細胞，采用Western Blot法檢測Akt1、p-Akt1以及URAT1蛋白的表達情況，觀察高濃度胰島素對HK-2細胞PI3K/Akt1信號通路以及URAT1蛋白表達的影響。3.用Western Blot法檢測不同濃度氯沙坦（氯沙坦?jié)舛确謩e為1、10、100μM）干預下高濃度胰島素誘導的HK-2細胞URAT1蛋白的表達；用Western Blot法檢測氯沙坦100

9、μM和PI3K/Ak t通路抑制劑LY294002對高濃度胰島素誘導的HK-2細胞URAT1、Akt1和p-Akt1蛋白的表達異同。
　　結果：1.（1）在MetS患者中，男性SUA和Sc r水平較女性高(均為P＜0.001)；（2）血胰島素和 HOMA-IR之間尿酸排泄各指標的比較：隨著空腹血胰島素水平的升高，FEUA明顯呈下降趨勢（F=8.920，P=0.004）；隨著餐后血胰島素水平的升高，24hUUA（2h PIns≥22

10、.2 mU/L）、FEUA以及CUA呈明顯下降趨勢（分別為F=7.548，P=0.007；F=9.620，P=0.002；F=15.736，P＜0.001）；HOMA-IR與24hUUA、FEUA、CUA、EurGF和UUA/Ucr的變化趨勢無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（；3）MetS患者尿酸排泄影響因素的單因素分析：男性MetS患者的UUA/Ucr水平低于女性(P=0.002)；非老年組(＜60歲) MetS患者的24hUUA、CUA

11、水平均顯著高于老年組(≥60歲) MetS患者(P＜0.01)；既往有糖尿病史的MetS患者的CUA水平較既往無糖尿病史的MetS患者的高(P＜0.05)，既往有高血壓病史的MetS患者24hUUA、FEUA、CUA、UUA/Ucr等水平均較既往無高血壓病史的MetS患者的低(P＜0.05)；收縮壓升高組(≥130 mmHg)的MetS患者24hUUA水平低于收縮壓正常組(＜130 mmHg)患者(P＜0.05)；根據BMI及腰圍分組，

12、MetS患者在24hUUA、FEUA、CUA、EurGF、UUA/Ucr上的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PBG升高組(≥7.8 mmol/L)較PBG正常組(＜7.8 mmol/L)24hUUA、CUA水平高(P＜0.05)，根據FBG、HbAlc分組，MetS患者在24hUUA、FEUA、CUA、EurGF以及 UUA/Ucr上的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；TG升高組(TG≥1.7 mmol/L)的24hUUA水平高于TG

13、正常組(TG＜1.7 mmol/L)(P＜0.05)。HDL-C降低組(男<1.0 mmol/L，女<1.3 mmol/L)的24hUUA、EurGF均低于HDL-C正常組(男≥1.0 mmol/L，女≥1.3 mmol/L)(P＜0.05)；eGFR≥90 ml/min/1.73 m2組的MetS患者CUA、UUA/Ucr水平均顯著高于eGFR＜90 ml/min/1.73 m2組MetS患者(P＜0.01)，≥90 ml/min/1

14、.73 m2組的MetS患者EurGF水平顯著低于＜90 ml/min/1.73 m2組MetS患者(P＜0.01)；24 h尿蛋白升高組(24 h尿蛋白≥0.15 g/24h)的MetS患者24hUUA、CUA水平高于24h尿蛋白正常組(24h尿蛋白＜0.15 g/24 h) Me tS患者(P＜0.05)。（4）對MetS患者的血尿酸水平與尿酸排泄指標進行相關分析結果顯示：FEUA、CUA、UUA/Ucr這3項指標與SUA水平呈負相

15、關(P＜0.05)。（5）MetS患者5項尿酸排泄指標影響因素的多元回歸分析：年齡和餐后胰島素均與24hUUA呈負相關，餐后血糖與24hUUA呈正相關，在男性患者中，影響24hUUA的主要因素是年齡、HDL-C和餐后胰島素，女性患者中則主要是年齡、尿蛋白以及甘油三酯；餐后血糖與 FEUA呈正相關，空腹胰島素與 FEUA呈負相關，在男性患者中，影響 F EUA的主要因素是空腹胰島素，女性患者中的影響因素則主要是餐后血糖；eGFR、餐后血糖

16、與CUA呈正相關，餐后胰島素與CUA呈負相關，在男性患者中，影響CUA的主要因素是eGFR、餐后胰島素，女性患者中的影響因素則主要是餐后血糖與年齡；eGFR、BMI均與EurGF呈負相關；eGFR與UUA/Ucr呈正相關，既往高血壓病史與UUA/Ucr呈負相關，在男性患者中，影響UUA/Ucr的主要因素是eGF R，女性患者中的影響因素則主要是既往高血壓病史與餐后血糖。2.不同濃度胰島素培養(yǎng)HK-2細胞UR A T1的mRN A和蛋白表

17、達較空白對照組明顯升高，且隨著干預時間延長及胰島素濃度的增加而表達量呈遞增趨勢（均P＜0.05），URAT1 mRNA和蛋白在胰島素100 nM干預48小時表達量達到高峰（分別較對照組升高1.57和1.80倍,均P＜0.05），因此在后續(xù)實驗中均采用此濃度及時間觀察；與對照組比較，高濃度胰島素（100 nM）可以增加p-Akt1蛋白的表達（P＜0.05），提示胰島素可以活化PI3K/Akt1信號通路；與對照組比較。LY294002可抑制

18、高濃度胰島素誘導的Akt1活化，可顯著減少 p-Akt1的表達（P＜0.01）；與高濃度胰島素組比較。LY294002可抑制高濃度胰島素誘導的URAT1蛋白表達（P＜0.05）。3.應用不同濃度氯沙坦干預HK-2細胞后，URAT1蛋白表達下降，且隨氯沙坦?jié)舛鹊脑龈?，URAT1表達逐漸下降，與高胰島素組存在明顯差異（P＜0.01）；與正常對照組比較，高濃度胰島素誘導的HK-2細胞內URAT1及p-Akt1表達明顯增加（P＜0.05），而A

19、k t1的表達并無明顯差異；與高濃度胰島素組比較，應用氯沙坦100μM干預HK-2細胞后p-Akt1及URAT1的表達下降（P＜0.05），應用LY294002干預HK-2細胞后p-Akt1及URAT1的表達顯著下降（P＜0.01），且其效應較而氯沙坦100μM干預組更強（P＜0.05），Akt1的表達并無明顯差異（P>0.05）。
　　結論：1.血胰島素水平升高是抑制腎小管尿酸排泄而導致血尿酸增高的主要影響因素，在代謝綜合征性高

20、尿酸血癥的發(fā)生機制中起著非常重要的作用；男性代謝綜合征患者較女性的血尿酸水平明顯增高，腎臟尿酸排泄能力下降可能是導致其血尿酸升高的原因之一，而血胰島素水平升高是它的獨立影響因素。因此，在代謝綜合征患者中改善高胰島素血癥對于預防血尿酸升高乃至高尿酸血癥具有積極意義。2.胰島素可通過時間與濃度依賴性的方式誘導人腎小管上皮細胞URAT1的表達，胰島素經上調 URAT1的表達來促進尿酸在近端腎小管的重吸收，這可能是MetS所致血尿酸升高或高尿酸

21、血癥的發(fā)生機制之一；高濃度胰島素經活化 PI3K/Akt1信號通路而上調HK-2細胞URAT1的表達。3.氯沙坦對高濃度胰島素誘導的HK-2細胞上調表達URA T1有明顯的抑制作用，其抑制作用隨著濃度的增大而增強，呈濃度依賴性；氯沙坦可經部分抑制腎小管上皮細胞PI3K/Akt1信號通路的活性而抑制高胰島素誘導的HK-2細胞URAT1上調表達，從而在伴高胰島素血癥狀態(tài)的MetS所致血尿酸升高或高尿酸血癥中起到抑制腎小管對尿酸的重吸收、促進