蛇床子素對帕金森病防治作用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、帕金森?。≒arkinson'sdiseasePD）是影響中老年人身體健康的主要神經(jīng)退行性疾病，其病因仍然不清。左旋多巴一直是治療PD的經(jīng)典藥物。然而，左旋多巴在連續(xù)用藥后會發(fā)生諸多副作用，而且左旋多巴治療并不能延緩多巴胺神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡。因此，臨床上急需研究療效好、副作用小的治療PD的藥物。許多研究證實中藥治療PD的效果是確切的，但都為復(fù)方制劑，用量大，作用機(jī)理和有效成分均不十分清楚。因此，研究療效可靠的中藥單體藥物及其作用機(jī)理具有

2、重要的臨床應(yīng)用意義。
　　中藥蛇床子是傘形科植物蛇床Cnidiummmonnier（L.）Cusson的干燥成熟果實，具有開竅祛痰、醒神益智、理氣活血等功效，在治療帕金森病的中藥復(fù)方中頻繁出現(xiàn)?，F(xiàn)代研究表明，蛇床子可增強(qiáng)腦細(xì)胞耐缺氧能力、改善腦循環(huán)，并有減少自由基損害的作用。蛇床子素（Osthole，OST）是蛇床子中最重要的活性單體成分，是一種很好的天然抗氧劑，具有抗氧化、抗衰老、抗血栓、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的作用。但其對帕金森病的治療

3、作用和機(jī)理方面的研究尚未見報道。
　　針對臨床需要，本文對蛇床子中OST進(jìn)行了深入研究，為將其開發(fā)成防治PD的新藥奠定了理論基礎(chǔ)。
　　第一部分蛇床子中OST的提取分離方法研究
　　目的：建立一種方便、高效的從蛇床子中提取分離有效成分OST的方法。
　　方法：分別采用有機(jī)溶劑萃取法、微波萃取和濁點萃取法從蛇床子中提取OST，再取蛇床子提取物用無水乙醇進(jìn)行多次重結(jié)晶純化，最后得到OST純品（純度＞98％）。

4、　　結(jié)果與結(jié)論：
　　首次采用環(huán)保型液液萃取技術(shù)-濁點萃取法提取OST，并對其進(jìn)行了HPLC定量分析。經(jīng)三種方法比較，濁點萃取法萃取率最高。中藥傳統(tǒng)的提取法多為有機(jī)溶劑萃取，均不同程度地存在有機(jī)溶劑用量大、處理時間長、步驟多、雜質(zhì)多、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點。而濁點萃取法不使用有機(jī)溶劑，克服了以上缺點。本實驗證明濁點萃取法代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑提取工藝提純OST效率和純度高，且有較高重現(xiàn)性。
　　第二部分OST體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究

5、>　　目的：測定給藥后大鼠血漿和腦中OST濃度的動態(tài)變化及藥動學(xué)參數(shù)?？疾霴ST透過血腦屏障的行為，為OST的臨床合理用藥提供可靠依據(jù)。
　　方法：取SD大鼠灌胃OST40.0mg/kg后，在給藥后不同的時間點采取血漿和腦組織，經(jīng)濁點萃取處理后，經(jīng)HPLC測定藥物含量。平均藥物含量-時間數(shù)據(jù)用DAS2.0程序擬合，按非房室模型的統(tǒng)計矩法進(jìn)行統(tǒng)計。
　　結(jié)果：大鼠灌胃OST的藥代動力學(xué)特點符合一級消除的二室開放模型，主要血漿藥

6、代動力學(xué)參數(shù)分別Cmax：2.72μg/mL；t1/2：5.26h；AUC0-t：10.49μg/h/mL；AUC0-∞：11.27μg/h/mL；tmax：0.56h。腦組織中OST達(dá)峰時間為0.56h，即在腦和血漿中同時達(dá)到峰值濃度，Cmax：1.06μg/mL，且其濃度在0.5-6h內(nèi)沒有顯著性變化，其藥物下降幅度僅為48％。
　　結(jié)論：1.濁點萃取法應(yīng)用于OST體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究中樣品的預(yù)處理過程方法簡便、可行。

7、　　2.從時間-濃度曲線中觀察到血漿中OST迅速分布，且消除較緩慢，說明OST能透過血腦屏障，且能在腦組織中停留較長時間。
　　第三部分OST對MPTP誘導(dǎo)C57BL小鼠PD的保護(hù)作用初步研究
　　目的:觀察OST對MPTP誘發(fā)PD模型小鼠的行為學(xué)及多巴胺能神經(jīng)元的影響，以探討OST對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　方法：小鼠隨機(jī)分為模型組、美多芭組、OST高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低劑量（25

8、mg/k）三組，另設(shè)正常對照組。腹腔注射MPTP復(fù)制PD小鼠模型，在造模前5d灌胃OST，連續(xù)13d持續(xù)到造模結(jié)束，并觀察OST對小鼠協(xié)調(diào)運動能力、TH陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)及黑質(zhì)多巴胺含量的影響。
　　結(jié)果：OST高、中劑量組、美多芭組給藥第2d后小鼠的協(xié)調(diào)運動能力均有不同程度恢復(fù)，與模型組比較（P＜0.05）；低劑量OST對PD小鼠協(xié)調(diào)運動能力改善不顯著（P＞0.05），模型組小鼠與治療前比較協(xié)調(diào)運動能力有顯著降低（P＜0.05），

9、正常組小鼠行為則無變化；免疫組化顯示OST高、中劑量腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量高于模型組（P＜0.05），而低于美多芭組（P＜0.05），但均低于正常組（P＞0.05）；高效液相色譜－電化學(xué)檢測結(jié)果表明，模型組大鼠中腦DA、DOPAC、HVA含量均低于OST高、中劑量組、美多芭組（P＜0.05或P＜0.01），但均低于正常組。低劑量OST的DA、DOPAC和HVA含量與模型組比較差異不顯著。
　　結(jié)論：OST可通過減輕PD模型小鼠腦

10、黑質(zhì)細(xì)胞的受損程度，促進(jìn)其修復(fù)，并升高DA、DOPAC及HVA水平和改善協(xié)調(diào)運動能力以達(dá)到防治帕金森病的作用。
　　第四部分OST對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型保護(hù)作用研究
　　目的：利用H2O2造成PC12細(xì)胞直接氧化應(yīng)激損傷，探討OST在神經(jīng)細(xì)胞中的抗氧化機(jī)制。利用觀測MPP+介導(dǎo)的PC12細(xì)胞間接氧化應(yīng)激損傷程度，探討OST在神經(jīng)細(xì)胞中的抗凋亡機(jī)制。
　　方法：以神經(jīng)毒素MPP+和H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡即為

11、PD體外細(xì)胞模型。采用形態(tài)學(xué)觀察、熒光染色、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)分析、流式細(xì)胞技術(shù)、DNA片斷化、RT-PCR和Westernblot蛋白印跡技術(shù)，在抗氧化、抗凋亡等方面，探討OST保護(hù)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：1.在H2O2介導(dǎo)的PC12細(xì)胞直接氧化應(yīng)激損傷模型中，OST劑量依賴地減少了細(xì)胞中LDH的漏出；通過細(xì)胞核的形態(tài)觀察以及流式細(xì)胞儀的分析，OST可以減少H2O2介導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡性死亡；OST抗H2

12、O2氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px和MDA等抗氧化酶的活性密切相關(guān)。
　　2.在MPP+介導(dǎo)的PC12細(xì)胞間接氧化應(yīng)激損傷模型中，LDH分析證明能夠保護(hù)質(zhì)膜的完整性而抑制MPP+介導(dǎo)的LDH漏出；形態(tài)觀察及流式細(xì)胞儀的分析，同樣證實OST可顯著抑制MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而且，OST能夠劑量依賴地降低凋亡/壞死細(xì)胞的比例。OST抑制MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可通過阻止膜電位（MMP）的喪失，抑制ROS的產(chǎn)生

13、，減少GSH的耗竭，促進(jìn)SOD和CAT的激活和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2的比率，抑制Caspase-3激活和CytochromeC的釋放及下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-кBP65蛋白。
　　結(jié)論：1.在受活性氧（ROS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷時，OST可以有效的保持PC12細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御體系處于正常的水平，從而抑制細(xì)胞的功能衰蝎而死亡。
　　2.OST可能通過調(diào)節(jié)線粒體的通透性而抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡。

14、>　　結(jié)論和意義：
　　1.本課題首次將濁點萃取法應(yīng)用于蛇床子中有效成分OST的提取分離和體內(nèi)藥代動力學(xué)研究中樣品的預(yù)處理過程，并分別進(jìn)行了實驗優(yōu)化，結(jié)果表明，該方法間便、高效、環(huán)保、適于規(guī)模操作，是一種非常有前途的分離和樣品預(yù)處理方法。
　　2.首次證明OST對MPTP所致PD模型小鼠的行為有明顯改善作用，并對MPTP所致小鼠腦中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的降低有提高作用，并可保護(hù)H2O2和MPP+介導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激引起的