口蹄疫病毒VP3定點突變體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性和免疫血清學(xué)研究.pdf

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種重大動物疫病，我國歷史上發(fā)生和近年來流行的有O、A和Asia1三個血清型，其中O型口蹄疫對我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的威脅最大。疫苗免疫是防控本病的重要手段，現(xiàn)有的市售口蹄疫疫苗包括常規(guī)滅活疫苗和合成肽疫苗。但是，前者不利于與口蹄疫病毒自然感染動物的鑒別診斷，后者在有新發(fā)外來病毒株入侵時可能會出現(xiàn)免疫失敗。目前，隨著口蹄疫反向疫苗學(xué)的發(fā)展，借助基因工程手段缺失或沉默口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫優(yōu)勢表位創(chuàng)制的負標記疫苗有效

2、解決了第一個瓶頸問題;本研究探索性地在口蹄疫病毒外部衣殼蛋白VP3的G-H環(huán)中進行靶向改造，旨在為廣譜、多聯(lián)（價）、正標記疫苗的研發(fā)提供借鑒性思路。
　　首先，為了評估外部衣殼蛋白VP3G-H環(huán)展示外源標簽的能力，本研究利用成熟的O型Cathay拓撲型口蹄疫病毒反向遺傳操作技術(shù)平臺(pOFS→rHN)，構(gòu)建了兩種HA插入型（第3171-3172位）的基因組全長cDNA。遺憾的是，未能拯救到基因工程毒。遂將HA、Flag、VSV-G

3、替換性引入該區(qū)段，構(gòu)建了六種外源標簽替換型的基因組全長cDNA。同樣地，也未能獲得基因工程毒，而且，其中一種HA替換型的口蹄疫病毒基因組全長cDNA經(jīng)密碼子優(yōu)化后仍無法獲得基因工程毒。這表明骨架病毒rHN的VP3G-H環(huán)中存在著與口蹄疫病毒感染性相關(guān)的關(guān)鍵性氨基酸。
　　為此，本研究對照一種HA修飾型質(zhì)粒，對骨架病毒的基因組全長感染性cDNA進行定點突變，構(gòu)建了四種突變型質(zhì)粒，同時，參考C型和SAT2型口蹄疫病毒代表株，構(gòu)建了三種

4、血清型間嵌合型質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染結(jié)果證實，僅有突變型質(zhì)粒pOFSv3174Y和血清型間嵌合型質(zhì)粒pOFSD3173N+V3174E+N3179C具有感染性，兩種定點突變體分別命名為rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。
　　最后，本研究對兩種定點突變體與骨架病毒進行了生物學(xué)特性鑒定和免疫血清學(xué)比較分析。試驗發(fā)現(xiàn)，①rHND3173N+V3174E+N3179C定點突變體在BHK-21細胞上連續(xù)傳代時容易引發(fā)假

5、回復(fù)突變和第二位點突變;②rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C細胞傳代毒均獲得了侵染CHO系列細胞的能力（非RGD依賴型受體），③rHN、rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遺傳穩(wěn)定株在BHK-21細胞上的蝕斑表型、復(fù)制動力學(xué)略有差異，但差異不顯著。④與rHN相比，rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遺傳穩(wěn)定株的體內(nèi)/外致病力均有下降，后者更為明顯

6、;⑤與rHN的免疫陽性血清相比，rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遺傳穩(wěn)定株的免疫陽性血清對我國現(xiàn)已分離的O型Mya98和PanAsia-1譜系FMDV的交叉中和能力均有不同程度的改變，且后者的r值均大于05(符合OIE規(guī)定標準，r≥0.3)。
　　上述研究結(jié)果提示，可通過嘗試性地在空間結(jié)構(gòu)上外露于病毒衣殼表面且靠近口蹄疫病毒抗原位點的莖環(huán)區(qū)進行氨基酸殘基的人為修飾，有望針對性地拓實口蹄疫疫苗候選株