共表達(dá)GPMV F基因和GPV VP3基因重組禽痘病毒生物學(xué)特性研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)對共表達(dá)鵝細(xì)小病毒VP3基因和鵝副粘病毒F 重組禽痘病毒(rFPV-VP3-F)的理化特性、遺傳穩(wěn)定性、蛋白在細(xì)胞上及商品雞體內(nèi)的表達(dá)情況做了初步的研究。首先對該病毒進(jìn)行純化，并通過PCR、Dot-ELISA等方法鑒定病毒外源基因存在及表達(dá)情況。在理化特性研究實(shí)驗(yàn)中，將經(jīng)理化因素處理的重組禽痘病毒(rFPV-VP3-F)，接種到雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上，觀察處理前后重組禽痘病毒對雞胚成纖維細(xì)胞的感染滴度的變化，得出該病毒的部分理

2、化學(xué)特性。通過按不同的細(xì)胞數(shù)目，不同的接毒量對病毒繁殖的影響，摸索出病毒繁殖的最佳細(xì)胞數(shù)及最佳感染復(fù)數(shù)是當(dāng)細(xì)胞密度為10 5/cm2，感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí)，病毒滴度可達(dá)3.08×10 5TCID50/100ul 。在重組禽痘病毒在遺傳穩(wěn)定性研究的實(shí)驗(yàn)中，主要是將重組禽痘病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳代20 代，抽查第5 代、第10代、15代和20代的遺傳穩(wěn)定性。
　　 從蝕斑的純度看，這幾代所出的蝕斑均為藍(lán)斑，未發(fā)生外源基因丟失而

3、產(chǎn)生白色蝕斑的情況。
　　 以第5代、10代、15代及20代重組禽痘病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出了460bp的F 基因部分片斷，657bp的VP3基因部分片斷。以另外兩對引物擴(kuò)增出F全長基因和VP3全長基因，測序后與原代相比較，F(xiàn)基因有兩個(gè)核苷酸了生的改變，氨基酸未發(fā)生變化。VP3有三個(gè)核苷酸發(fā)生了變化，氨基酸也未發(fā)生改變。通過間接免疫熒光試驗(yàn)檢測第5代、第10代、第15代和第20代重組禽痘病毒F 、VP3基因表達(dá)

4、情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，以上幾代重組禽痘病毒中的兩個(gè)外源基因均可在CEF 中穩(wěn)定表達(dá)。綜上所述，說明該重組禽痘具有較好的遺傳穩(wěn)定性，外源基因在傳代過程中不會丟失，并可正確的表達(dá)相應(yīng)的蛋白。將rFPV-VP3-F按106PFU/羽的量皮下接種于35 日齡未經(jīng)免疫的商品雞，于免疫后的第7d、14d、21d、28d和35d 采血分離血清，通過中和抗體檢測抗GPMV-F基因的抗體水平，通過間接ELISA 方法檢測抗GPV-VP3基因的抗體水平。結(jié)果