辣椒葉片響應(yīng)UV的cDNA文庫的構(gòu)建及WRKY的cDNA的篩選.pdf

1、分類號：Q78密級：福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文Y949389單位代碼：10389學(xué)號：1031607辣椒葉片響應(yīng)UV的cDNA文庫的構(gòu)建及WRKY的cDNA的篩選學(xué)科門類：理學(xué)一級學(xué)科：生物學(xué)二級學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：植物化學(xué)與分子生物學(xué)研究生：夏信明指導(dǎo)教師：何水林教授完成時間：二OO六年四月摘要WRKY等轉(zhuǎn)錄因子在植物防御反應(yīng)途徑中起著十分重要的作用，本研究利用經(jīng)uV處理的抗病辣椒品種的葉片，在優(yōu)化了其RNA提取方法的基

2、礎(chǔ)上提取其總RNA，構(gòu)建了cDNA文庫，篩選文庫獲得WRKY轉(zhuǎn)錄因子的陽性cDNA克隆，為進(jìn)～步研究WRKY在辣椒UV脅迫下的防御反應(yīng)中的可能作用奠定基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：1cDNA文庫的構(gòu)建以紫外輻射處理過的辣椒葉片為研究材料，經(jīng)實驗比較后選擇小量柱離心式植物總RNA抽提試劑盒來提取總RNA，所提取的RNA可滿足構(gòu)建文庫的要求。cDNA文庫的構(gòu)建采用SMARTTM文庫構(gòu)建試劑盒參照其所附的說明進(jìn)行：利用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶把總RNA中的

3、mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異引物進(jìn)行LDPCR擴增臺成雙鏈cDNA；用CtlROMASPIN一400Column對cDNA進(jìn)行分級分離，去除小于400bp的cDNA片段；用帶有粘性末端的雙鏈cDNA與XTriplEx2載體連接，利用^噬菌體包裝蛋白對合成的雙鏈cDNA進(jìn)行體外包裝，包裝產(chǎn)物侵染EcoliXL—Blue獲得cDNA初始文庫，含有217106獨立的pfu，其擴增后文庫的滴度為377～389108pfu／ml，插入片段平均

4、大小在lkb左右，隨機對插入片斷經(jīng)過PCR鑒定后證實其重組率為93％，表明所構(gòu)建cDNA文庫質(zhì)量較好，可用于進(jìn)一步用于辣椒uV響應(yīng)的特定基因的cDNA篩選。2WRKY基因的篩選根據(jù)擬南芥的WRKY蛋白的氨基酸序列，搜索獲得辣椒相關(guān)EST，并進(jìn)一步用DNAMAN軟件將這些EST拼接起來，根據(jù)拼接的序列來設(shè)計、合成引物。用基于PCR的96孔板篩選方法從UV處理的辣椒葉片cDNA文庫中分離獲得陽性克隆，其序列與已經(jīng)報道的水稻、煙草等作物的WR