珙酮葉片cDNA文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、珙桐為第三紀(jì)古熱帶植物區(qū)系的孑遺種,為國(guó)家一級(jí)保護(hù)珍稀瀕危植物,也是世界著名的觀賞木本花卉。到目前為止,關(guān)于珙桐宏觀研究的報(bào)道已有許多,但是關(guān)于珙桐分子方面的基礎(chǔ)研究相對(duì)缺乏。為了探討珙桐含有的特有種屬基因,保存珙桐的資源信息庫(kù),本論文實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了珙桐葉片組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù),并對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行了初步鑒定。
　　 本論文實(shí)驗(yàn)以珙桐葉片為研究材料,采用Trizol法和Rneasy Plant Mini Kit法提取珙桐葉片組織總RN

2、A,檢測(cè)結(jié)果表明用Rneasy Plant Mini Kit法提取的效果較好。基于此結(jié)果本實(shí)驗(yàn)用Rneasy Plant Mini Kit法提取珙桐葉片總RNA為SMARTTM cDNA Library Construction Kit的起始材料合成全長(zhǎng)cDNA并連接到λTriplEx2載體上,Gigapack(R)Ⅲ Gold Packaging包裝重組λDNA。包裝好的噬菌體顆粒侵染E.coli XL1-Blue、BM25.8大腸桿

3、菌,成功構(gòu)建了珙桐葉片組織的cDNA文庫(kù)。
　　 珙桐葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,長(zhǎng)距離PCR方法合成雙鏈cDNA；PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化后,用SfiI酶切；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離,回收0.5kb以上的cDNA組分,并與入TriplEx2載體連接；連接產(chǎn)物經(jīng)體外蛋白包裝,產(chǎn)生原始文庫(kù)；鑒定文庫(kù)的滴度和重組效率后,進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增和保存。隨機(jī)挑取40個(gè)噬菌斑,用載體克隆位點(diǎn)兩端的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測(cè)所構(gòu)建的cDNA文

4、庫(kù)的質(zhì)量。經(jīng)測(cè)定該文庫(kù)初始滴度為6.3×106 pfu/ml,重組率為97.4％；擴(kuò)增后滴度為5.16×107pfu/ml；插入片段長(zhǎng)度為0.4～2.0kb。由于反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中采用附加序列的方法使全長(zhǎng)mRNA得到反轉(zhuǎn)錄,所以得到的cDNA是完整的,完全符合cDNA文庫(kù)的要求。通過(guò)對(duì)cDNA文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè),文庫(kù)中插入片段長(zhǎng)度的長(zhǎng)度、文庫(kù)的滴度以及重組率都符合cDNA文庫(kù)的要求。
　　 珙桐葉片λ噬菌體cDNA文庫(kù)的成功構(gòu)建,為進(jìn)一步