經(jīng)口急性砷暴露誘發(fā)小鼠肺臟免疫炎癥反應(yīng)及其可能機制.pdf

1、目的:
　　砷是一種有毒的類金屬元素，廣泛存在于地殼、土壤、海水、大氣和食物中。早在1987年，砷及其化合物就被國際癌癥研究機構(gòu)(international agency forresearch on cancer，IARC)確認為人類Ⅰ類致癌物，損傷機體多種組織、器官或系統(tǒng)。砷作為一種全身性毒物，慢性飲水無機砷暴露可以引起皮膚過度角化、色素沉著、神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及皮膚、膀胱、肺、肝等實質(zhì)器官腫瘤，此外還與糖尿病、心腦血管疾病等發(fā)病

2、風(fēng)險的增加有關(guān)。砷的廣泛分布及其對機體造成的許多不良影響，使得砷暴露對人類健康的危害已經(jīng)成為世界嚴重的公共衛(wèi)生問題。
　　呼吸道吸入砷作為職業(yè)性砷暴露的重要途徑，主要集中在一些農(nóng)業(yè)和工業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)，沿海地區(qū)主要是通過水生食物攝入有機砷，而通過飲水方式攝入則是廣大砷病區(qū)人群無機砷暴露的最主要途徑。有趣的是，無論是呼吸道吸入還是消化道攝取，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)無機砷暴露都可以誘導(dǎo)肺癌高發(fā)，其主要取決于無機砷的吸入/攝入劑量。無論何種

3、途徑的砷暴露都使得肺組織成為砷毒性最敏感的器官之一，長期飲水砷暴露與肺癌發(fā)病率之間存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。此外，越來越多的證據(jù)表明長期接觸無機砷還會降低肺功能、增加罹患肺部疾病的風(fēng)險，增加支氣管擴張。尤其在胎兒、嬰兒時期砷暴露，會明顯增加肺部機會性致病菌感染風(fēng)險，引起肺結(jié)核、呼吸道感染等疾病的發(fā)生，表現(xiàn)為炎癥、不可逆性支氣管損傷以及呼吸衰竭等。
　　砷暴露還被證實可活化一些轉(zhuǎn)錄因子，例如AP-1、HIFs、NF-κB以及Nrf2

4、等，這些轉(zhuǎn)錄因子都參與各種炎癥介質(zhì)的合成及其生理調(diào)控。NF-κB作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號通路，研究表明無機砷暴露使IκB磷酸化，激活NF-κB，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄，促進炎性介質(zhì)(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌，在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。也有報道稱在砷暴露誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中，MAPK信號通路，主要是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基未端激酶

5、(c-Jun N-Terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)，參與調(diào)節(jié)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。有研究表明，P38MAPK的激活可以使巨噬細胞產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，與JNK一起通過c-jun磷酸化激活A(yù)P-1，進而調(diào)控IL-6和TNF-α的釋放。磷酸化的P38和JNK表達降低時可抑制促炎細胞因子的IL-1β

6、、IL-6和TNF-α分泌。
　　綜上所述，目前針對砷誘導(dǎo)肺炎癥反應(yīng)的研究主要集中在細胞學(xué)實驗，少數(shù)體內(nèi)實驗研究也主要采用氣道吸入式染毒，模擬人群飲水砷暴露方式的經(jīng)口砷暴露的整體動物實驗尚未見報道。砷暴露誘導(dǎo)肺組織免疫/炎癥反應(yīng)相關(guān)作用機理亦尚不清楚。本研究以亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)為處理因素，觀察經(jīng)口急性無機砷暴露對C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage flu

7、id，BALF)及肺組織的炎癥反應(yīng)、Th1/Th2細胞因子和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及MAPK、Nrf2等信號通路的可能影響，試圖探討飲水砷暴露誘發(fā)小鼠肺免疫炎性反應(yīng)及其可能機制，為深入研究無機砷致肺部疾病和肺癌的發(fā)病機制提供新的實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、實驗動物與分組:
　　健康C57BL/6雌性小鼠100只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠按體重隨機按數(shù)字表分組。采用一次性灌胃方式染毒，染毒濃度分別為2.5 mg/kg、5 m

8、g/kg和10mg/kg NaAsO2，對照組采用生理鹽水灌胃，染毒時間分別為6、12、24 h，共計10組，每組10只。染毒期間各組小鼠均喂養(yǎng)普通飼料。染毒終點，眼球取血，提取BALF并摘取肺組織，部分甲醛固定，用于病理實驗;部分保存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　2、檢測指標(biāo)與方法:
　　(1)肺組織砷含量測定:高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子吸收測定法
　　(2)肺組織病理改變:采用HE染色的方法
　　(3)BALF中

9、細胞數(shù)目和形態(tài):Countstar細胞計數(shù)和Diff-Quik染色
　　(4)BALF中蛋白濃度和細胞因子含量的檢測:采用BCA試劑盒和ELISA檢測試劑盒
　　(5)肺組織氧化應(yīng)激檢測:采用南京建成公司試劑盒測定肺組織MDA含量、GSH-Px和CAT活力
　　(6)肺組織炎性損傷檢測:采用南京建成公司試劑盒測定肺組織MPO活力;RT-PCR法檢測肺組織中Th1/Th2相關(guān)細胞因子(T-bet、IL-2、IFN-γ、G

10、ATA-3、IL-4、IL-10)和炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和MIP-2)基因的mRNA表達水平
　　(7)肺組織MAPK和Nrf2信號通路蛋白表達水平:采用Western-Blot方法
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)口急性砷暴露小鼠肺組織臟器系數(shù)和總砷含量
　　與對照組比，各NaAsO2染毒組小鼠肺組織重量和臟器系數(shù)無明顯改變;肺組織中總砷含量隨NaAsO2染毒劑量增加而增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，在6h達到最高

11、，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　2、經(jīng)口急性砷暴露小鼠的肺臟組織病理情況
　　對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)正常，肺泡腔明亮無積液，2.5 mg/kg和5 mg/kg NaAsO2染毒組小鼠肺組織未見明顯異常，只有10 mg/kg染毒組小鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)遭到輕微的破壞，少部分肺泡塌陷，上皮細胞排列不均勻，偶見炎性細胞，并未見到肺泡腔內(nèi)積液和出血。
　　3、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠BALF炎性相關(guān)功能指標(biāo)的影響<

12、br>　　(1)經(jīng)口急性砷暴露小鼠BALF中細胞分類計數(shù)
　　與對照組相比，各NaAsO2染毒組小鼠BALF中細胞總數(shù)明顯增多;淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)目和所占百分比也隨之增加，巨噬細胞數(shù)目表現(xiàn)出增加趨勢但其所占比有所降低，可能是由于炎癥反應(yīng)的發(fā)生，淋巴細胞聚集和中性粒細胞趨化作用增強所致。
　　(2)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠BALF中蛋白濃度影響
　　與對照組相比，6h、12h和24h的10 mg/kg NaAsO2染毒組

13、小鼠BALF中蛋白濃度顯著升高;24h的5 mg/kg和10 mg/kg NaAsO2染毒組小鼠BALF中蛋白濃度明顯增多，且差異具有顯著性(p＜0.05）。
　　(3)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠BALF中細胞因子含量的影響
　　與對照組相比，2.5 mg/kg、5 mg/kg和10 mg/kg NaAsO2染毒組小鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均升高，以TNF-α升高最突出，差異具有顯著性(p＜0.05)。

14、r>　　4、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響
　　(1)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織MPO活性的影響
　　與對照組相比，急性砷暴露小鼠肺組織中MPO活性在5和10 mg/kg NaAsO2暴露組明顯增加，差異具有顯著性(p＜0.05）。
　　(2)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織炎性細胞因子mRNA表達影響
　　與對照組相比，各染毒組小鼠肺組織中炎性細胞因子(MIP-2、IL-1β、IL-6)mRNA表達水平顯著

15、升高，差異具有顯著性(p＜0.05）。
　　(3)經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織Th1/Th2細胞因子mRNA水平的影響
　　與對照組相比，NaAsO2染毒組小鼠肺組織中Th1轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)和相關(guān)細胞因子(IL-2、IFN-γ) mRNA表達水平有所降低，而肺組織中Th2轉(zhuǎn)錄因子(GATA-3)和相關(guān)細胞因子（IL-4、IL-10）mRNA表達明顯升高，差異具有顯著性(p＜0.05）。
　　5、經(jīng)口急性砷暴露小鼠肺

16、組織氧化應(yīng)激情況
　　與對照組相比，小鼠肺組織MDA含量隨著NaAsO2染毒劑量的增加而增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，同時GSH-Px和CAT活力與對照組相比明顯降低，差異具有顯著性(p＜0.05）。
　　6、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織MAPK通路及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響
　　與對照組比，NaAsO2染毒組磷酸化P38和JNK蛋白表達水平明顯增加，差異具有顯著性(p＜0.05）;而磷酸化ERK蛋白表達水平幾乎不變，可能

17、是由于P38和JNK主要在炎癥以及凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用，而ERK優(yōu)先調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。此外，急性砷暴露明顯增加MAPK下游調(diào)控因子NF-κB的蛋白水平，差異具有顯著性(p＜0.05）。
　　7、經(jīng)口急性砷暴露對小鼠肺組織Nrf2通路及下游轉(zhuǎn)錄因子影響
　　與對照組比，各NaAsO2染毒組，NRF2蛋白和mRNA表達水平均增加并在5mg/kg時達到最高，差異均具有顯著性(p＜0.05）;此外，Nrf2所調(diào)控的下游抗氧化

18、酶(HO-1)和Ⅱ相解毒酶(GSTO1/2)蛋白表達水平均明顯增加，Hmox-1、Gsto1mRNA表達水平也呈現(xiàn)增加趨勢，且差異均具有顯著性(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)口急性砷暴露引起小鼠肺泡灌洗液中炎性細胞數(shù)、蛋白濃度、促炎細胞因子含量的增加。
　　2、經(jīng)口急性砷暴露誘導(dǎo)小鼠肺組織免疫/炎癥反應(yīng)、Th1/Th2比例失衡和氧化應(yīng)激。
　　3、經(jīng)口急性砷暴露激活小鼠肺組織MAPK通路及下游轉(zhuǎn)錄因子N