丹參酚酸A對腦缺血后Notch通路相關(guān)蛋白作用的研究.pdf

1、目的：研究丹參酚酸A對成年大鼠缺血性腦損傷后Notch通路相關(guān)蛋白的影響，為中藥單體制劑應(yīng)用于腦梗死的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究分為兩個部分，第一個部分，以健康Sprangue-Dawley(SD)雄性大鼠為研究對象，將54只雄性SD大鼠隨機分成三組，每組18只，分別為假手術(shù)組（sham operation group，SO）、大腦中動脈閉塞模型組（middle cerebral artery occlusion gro

2、up，MCAO）、MCAO+丹參酚酸A（MCAO+Salvianolic acid A group，MCAO+SalA）組，SO組不做缺血處理，給予正常劑量麻醉劑，切開皮膚，不插入線栓；MCAO組和MCAO+SalA組均采用線栓法制備腦梗死模型。手術(shù)后SO組和MCAO組按10ml/Kg注射生理鹽水，術(shù)后6h在注射一次相同量的生理鹽水，MCAO+SalA組術(shù)后，將3mg丹參酚酸A溶解于10ml生理鹽水中，按3mg/Kg腹腔注射,術(shù)后6h再

3、注射一次相同劑量的丹參酚酸A。模型建立后在大鼠醒后評分一次，模型建立24h后進行第二次神經(jīng)功能評分，評分后斷頸取腦，進行TTC染色法測定腦梗死體積，HE染色法觀察腦組織結(jié)構(gòu)變化，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡、免疫組化和Western Blot檢測Notch通路的目標(biāo)蛋白Hes-1、Hes-5、NICD表達(dá)水平的變化。第二部分.本實驗以大鼠腦片為研究對象，分為對照組（comparison group，C）、丹參酚酸A組（Salvianolic

4、 acid A group，SalA）和Notch通路激活劑Jagged1+丹參酚酸A組（Jagged1+ Salvianolic acid A group,J+SalA），取6只成年雄性SD大鼠，每只斷頸取腦后，取海馬，切成400μm厚的腦片，取6片結(jié)構(gòu)完整的腦片，置于人工腦脊液中孵育40min，移至腦片灌流系統(tǒng)中，C組在電位穩(wěn)定15min后，再經(jīng)過一個15min陰性對照時間后，給予缺氧缺糖處理14min，之后再給予復(fù)氧復(fù)糖30min

5、；SalA組電位穩(wěn)定15min，給予SalA600μmol/L灌流15min后進行缺氧缺糖處理14min，復(fù)氧復(fù)糖30min；J+SalA組，電位穩(wěn)定15min，給予1mg/L的Jagged1+600μmol/L的SalA，灌流15min后，進行缺氧缺糖處理14min，再復(fù)氧復(fù)糖；主要觀察fEPSP斜率的變化。
　　結(jié)果：（1）神經(jīng)功能評分：假手術(shù)組無神經(jīng)功能障礙，丹參酚酸A組24h神經(jīng)功能評分較醒后評分下降了0.94±0.680

6、，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）TTC染色分析：MCAO組與SO組差異明顯，說明造模成功；MCAO組的梗死體積明顯高于MCAO+SalA組（t=2.63 P=0.039’,P＜0.05），說明給藥有效。（3）HE染色提示：SO組術(shù)側(cè)半球神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)未見異常。MCAO組缺血區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，胞核皺縮或破碎溶解，胞漿深染，缺血周邊有不同程度的滲出，血管擴張。MCAO+SalA組的缺血性改變，神經(jīng)細(xì)胞壞死、胞核深染、粒細(xì)胞滲出、細(xì)胞腫

7、脹的程度較MCAO組輕。（4）TUNEL檢測細(xì)胞凋亡提示：SO組可偶見陽性細(xì)胞，MCAO組與SO組比較，陽性細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），MCAO+SalA組與MCAO組比較，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)差異（t=8.717，P＜0.05）。（5）免疫組化提示：Hes-1的表達(dá)在胞核及胞漿，Hes-5的表達(dá)以胞漿及胞膜表達(dá)明顯，NICD主要表達(dá)于胞核內(nèi)。這三種蛋白造模后的表達(dá)量較假手術(shù)組明顯上升（P＜0.05），給藥后的表達(dá)量較模型組明

8、顯下降（P＜0.05）。（6）Western Blot結(jié)果顯示：相對于SO組，MCAO組大鼠Notch通路的靶蛋白明顯增加（P＜0.05），給予丹參酚酸A后，靶蛋白較MCAO組下降（P＜0.05）。（7）海馬腦片技術(shù)：對照組氧糖剝離后海馬腦片fEPSP的斜率比為51.25±13.68％。丹參酚酸A灌流后，腦片fEPSP的斜率比為89.50±7.46%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），給藥能夠起到神經(jīng)保護作用。給予Notch通路