抑制心肌組織骨橋蛋白的表達(dá)減輕擴(kuò)張型心肌病小鼠心室重構(gòu)以及黏著斑激酶介導(dǎo)骨橋蛋白誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原纖維的研究.pdf

1、本文主要從以下兩部分展開(kāi)論述：
　　第一部分:抑制心肌組織骨橋蛋白的表達(dá)減輕擴(kuò)張型心肌病小鼠心室重構(gòu)
　　目的:骨橋蛋白是體內(nèi)一種多種功能的細(xì)胞因子，參與集體多種生物學(xué)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白與心肌纖維化有著密切聯(lián)系。在原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病心臟組織以及壓力負(fù)荷增大而引起擴(kuò)張型心肌病的心臟組織中均發(fā)現(xiàn)OPN表達(dá)量有異常增高。有研究報(bào)道，心肌細(xì)胞過(guò)量表達(dá)OPN能誘發(fā)擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生。黏著斑激酶是胞漿內(nèi)的一種酪氨酸激酶，在細(xì)胞的遷移

2、增殖以及生存方面起重要作用。并且參與OPN相關(guān)的的信號(hào)通路。我們實(shí)驗(yàn)主要目的是探究OPN在擴(kuò)張型心肌病的病理，以及OPN與FAK在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化和心肌重構(gòu)中的作用。
　　方法:選用自發(fā)性擴(kuò)張型心肌病小鼠模型cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。8周大小時(shí)進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，并在心臟左心室游離壁注射載有OPN-shRNA的慢病毒，達(dá)到沉默心肌組織表達(dá)OPN的效果。實(shí)驗(yàn)分為3組，假手術(shù)組，僅進(jìn)行手術(shù)，不注射藥物。對(duì)照病毒組，注射不

3、含shRNA的對(duì)照病毒，OPN-shRNA抑制組，注射含有OPN-shRNA的慢病毒。4周后進(jìn)行小鼠超聲檢測(cè)評(píng)價(jià)心臟擴(kuò)張程度以及左室功能。取材，提取蛋白和mRNA進(jìn)行western blot以及PCR實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)心臟組織Ⅰ型膠原纖維和磷酸化FAK的表達(dá)。用MASSON染色的方法檢測(cè)心肌纖維化和心室重構(gòu)程度。
　　結(jié)果:OPN-shRNA抑制組的小鼠射血分?jǐn)?shù)，左室短軸縮短率較高，收縮期左室前壁較厚，表明OPN抑制有助于擴(kuò)張型心肌病的

4、心功能改善。Masson染色顯示OPN-shRNA抑制組小鼠心肌纖維化明顯輕于另外兩組。此外western blot，PCR結(jié)果顯示OPN-shRNA抑制組的小鼠α-SMA，Ⅰ型膠原以及磷酸化FAK, Akt表達(dá)較少。
　　結(jié)論:抑制擴(kuò)張型心肌病心肌組織中OPN的表達(dá)，能達(dá)到減輕心肌纖維化的程度，減少心室重構(gòu)，增強(qiáng)擴(kuò)張型心肌病心臟功能的作用。
　　第二部分:黏著斑激酶介導(dǎo)骨橋蛋白誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞分化以及Ⅰ型膠原的合成

5、r>　　黏著斑激酶(Focal Adhesion Kinase，F(xiàn)AK)是一種非酪氨酸激酶，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于十分重要的位置，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞存活。在近年來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK與各器官的纖維化存在著重要的作用。我們假設(shè)，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)一種與纖維化關(guān)系緊密的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，能夠刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，并且這一過(guò)程是經(jīng)過(guò)FAK介導(dǎo)的。因此我們提取小鼠乳鼠心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證這一假設(shè)，用骨橋蛋白刺激

6、小鼠成纖維細(xì)胞，并且在刺激前12小時(shí)給予FAK抑制劑抑制FAK活性。用western blot和ELISA方法分別檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞上清液Ⅰ型膠原的含量，用免疫熒光方法檢測(cè)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPN能導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白，并且這種作用能被FAK抑制劑所減弱。我們得出結(jié)論，F(xiàn)AK能夠在OPN誘導(dǎo)小鼠心臟成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞以及心臟的纖維化過(guò)程中起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)有可能對(duì)于纖維化