擴張型、肥厚型心肌病心肌重塑的蛋白質(zhì)及信號通路研究.pdf

1、目的：本課題觀察8例心臟擴張、心力衰竭進行心臟移植或心臟手術(shù)患者的左室心肌組織cTnI磷酸化、降解片段及PKC信號通路變化，經(jīng)腹腔注射抗cTnI單克隆抗體以期制備出免疫性DCM小鼠模型，探討cTnI磷酸化、降解及PKC信號通路調(diào)節(jié)在DCM發(fā)生、發(fā)展中的作用；研究cTnIR146W-EGFP突變小鼠重塑心肌組織以及缺血缺氧、異丙基腎上腺素干預培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞內(nèi)cTnI磷酸化及降解作用、PKC信號通路的變化，以期在分子細胞學水平探討cT

2、nI磷酸化、降解以及PKC信號通路調(diào)節(jié)與DCM、HCM心肌重塑發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，試圖闡述“肌絲重構(gòu)”在心肌病發(fā)病機制中的作用，為臨床診斷和治療提供分子病理學理論基礎(chǔ)。 內(nèi)容與方法：1.4例DCM、3例其他病因致心室擴張進行心臟移植術(shù)受體心臟、1例行雙瓣膜置換及左心室改良術(shù)，部分左室切除心肌組織，6例正常心臟，心肌病患者心肌組織行光鏡、電鏡病理學檢測；左心室組織勻漿提取總蛋白，卡馬斯亮藍定量，定量后總蛋白分別用抗磷酸化、去磷酸化及

3、不同表位的cTnI單克隆抗體、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ單克隆抗體作為一抗、抗GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參WesternBlotting方法檢測磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表達。 2.4周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為三組，于第0天、7天、21天、35天、49天、63天、77天分別腹腔注射2株抗cTnI單克隆抗體及IgG，觀察小鼠生長情況。于停止免疫2月(小鼠25周齡)、4月(小鼠33周齡)行二維超

4、聲心動圖檢查，摘眼球取血處死，稱取小鼠體重、心臟濕重，取心尖部橫截面10﹪甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察心肌病理改變。ELISA法測定血清cTnI，心肌組織勻漿提取總蛋白，卡馬斯亮藍定量后用抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI單克隆抗體、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ單克隆抗體作為一抗、抗GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參WesternBlotting方法檢測磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表達。 3.含報告基

5、因增強型綠色熒光蛋白EGFP-cTnIR146W突變基因的肥厚型心肌病模型小鼠6只(HCM組)，對照組小鼠6只(N組)，均為BALB/c小鼠，全雌性，20周齡時行二維超聲心動圖檢查，摘眼球取血處死小鼠，摘取小鼠心臟后拍攝照片，稱取小鼠心臟濕重、取心尖部橫截面10﹪甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察心肌病理改變；用抗EGFP單克隆抗體、抗cTnI單克隆抗體采用免疫組化法檢測心肌組織內(nèi)EGFP、cTnI表達；勻漿提取總蛋白，卡馬斯亮藍定量后用抗

6、EGFP、抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI單克隆抗體、作為一抗、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ單克隆抗體作為一抗，抗GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參WesternBlotting方法檢測磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表達。 4.培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞，用不同濃度ISO(10-4mol-L、10-5mol/L)及缺血缺氧干預2h、4h、6h，分別在光鏡下觀察各組心肌細胞的形態(tài)并記數(shù)一分鐘內(nèi)的心肌細胞搏動率，

7、ELISA法測定各組培養(yǎng)心肌細胞上清cTnI的變化；RIPA細胞裂解提取胞漿蛋白，考馬斯亮藍法蛋白定量，用抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI單克隆抗體、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ單克隆抗體作為一抗、抗GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參WesternBlotting方法檢測磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表達。 5.統(tǒng)計學方法：結(jié)果均以均數(shù)±標準差(x±SD)表示，QuantityOne4.5.2Quant

8、itationSoftware(Bio-Rad，USA)軟件半定量檢測，SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行組間比較t檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)果：1.擴張型心肌病患者心肌組織cTnI降解片段WesternBlotting檢測結(jié)果顯示：4例DCM及4例其他心肌病患者心肌內(nèi)抗cTnI單克隆抗體3E3、8I-7、MF4均檢測到cTnI表達及降解片段，抗體2I-14檢測在第四例心肌炎后心肌病患者心肌內(nèi)檢測到cTnI表達及降解條帶，

9、其他7例心肌病患者心肌內(nèi)檢測到cTnI表達但未見降解條帶；6例正常心臟左室內(nèi)均可見cTnI表達，未見降解條帶。 2.擴張型心肌病患者心肌組織磷酸化、去磷酸化cTnI及PKCWesternBlotting檢測結(jié)果：4例DCM患者、4例其他心肌病患者左室心肌組織在30kDa附近均有明顯磷酸化cTnI表達，半定量結(jié)果均明顯高于對照組(P＜0.05)，兩組心肌病表達比較無顯著性差異(P＞0.05)；4例DCM患者及4例其他心肌病患者左室

10、心肌組織內(nèi)均可見程度不同的去磷酸化cTnI表達，同時第四例心肌炎后心肌病患者左室心肌組織內(nèi)出現(xiàn)強烈的去磷酸化cTnI表達，并出現(xiàn)明顯降解條帶，正常組左室心肌組織內(nèi)未出現(xiàn)明顯去磷酸化cTnI表達；抗PKCβ1、PKCβ2單克隆抗體在4例DCM患者、4例其他心肌病患者及正常對照組左室心肌組織內(nèi)均未檢測到明顯的PKCβ1、PKCβ2表達。 3.抗cTnI單克隆抗體注射免疫小鼠心肌病理學檢測未見心肌纖維排列紊亂、肌絲斷裂、膠原纖維增生等

11、擴張型心肌病改變，與正常對照組相比無明顯區(qū)別，心臟二維超聲心動圖檢查未見明顯心腔擴大、心室壁變薄、收縮功能降低等擴張型心肌病改變，心臟濕重/體重比與正常組無顯著差異(P＞0.05)，血清cTnI水平正常，與對照組無顯著性差異(P＞0.05)?？筩TnI單克隆抗體注射免疫小鼠及對照組小鼠心肌組織內(nèi)均可見明顯磷酸化cTnI或較弱去磷酸化cTnI表達，在58kDa、28kDa附近均可見較弱PKCβ1、PKCβ2、PKCγ表達，半定量結(jié)果兩組之

12、間無顯著性差異(P均＞0.05)；抗cTnI單克隆抗體3E3、2I-14、8I-7、MF4均檢測到不同程度cTnI表達，比較無明顯差異(P均＞0.05)，未見降解條帶。 4.cTnIR146W-EGFP突變HCM小鼠20周時解剖發(fā)現(xiàn)心臟明顯肥大，心臟濕重/體重比較正常組明顯增高(P＜0.05)，二維超聲心動圖檢測見HCM組小鼠室間隔明顯肥厚，室間隔與左室后壁之比超過1.3，左室收縮末期內(nèi)徑小于正常組，左室EF值、FS無明顯差異(

13、P＞0.05)；病理學檢查光鏡下見心肌細胞肥大、排列紊亂，間質(zhì)血管增生，少量炎性細胞浸潤；免疫組化檢測，在HCM小鼠和對照組小鼠心肌組織內(nèi)均未檢測到cTnI或EGFP表達。 5.cTnIR146W-EGFP突變HCM小鼠心肌組織及其它器官組織，分別應(yīng)用抗EGFP及抗cTnI單克隆抗體WesternBlotting檢測結(jié)果顯示，在55kDa附近分別見與cTnIR146W-EGFP分子量(30kDa+26kDa)相符明顯條帶，在28

14、kDa附近可見cTnIR146w-EGFP降解條帶，正常對照組未見表達；在30kDa心肌組織抗cTnI單克隆抗體檢測見cTnI表達，其余組織均未見cTnI表達。 6.cTnIR146W-EGFP突變HCM小鼠心肌組織在55kDa附近可見磷酸化、去磷酸化cTnIR146w-EGFP表達條帶，在28kDa可見磷酸化、去磷酸化cTnI降解條帶；在30kDa附近兩組小鼠心肌組織均未見內(nèi)源性去磷酸化cTnI表達，但可見明顯內(nèi)源性磷酸化cT

15、nI表達，半定量檢測結(jié)果顯示HCM組明顯高于正常對照組(P＜0.05)；HCM小鼠和正常對照組小鼠心肌組織均可見PKCβ1、PKCβ2、PKCγ表達，半定量檢測結(jié)果顯示HCM組明顯高于對照組(P＜0.05～0.01)，HCM組PKCγ顯著高于PKCβ1(P＜0.01)和PKCβ2(P＜0.05)，PKCβ1與PKCβ2之間比較無顯著性差異(P＞0.05)，正常組PKCβ1、PKCβ2、PKCγ表達無顯著性差異(P＞0.05)。

16、7.cTnIR146W-EGFP突變HCM小鼠心肌組織cTnI及降解片段westernBlotting檢測結(jié)果顯示：抗cTnI單克隆抗體(Clone3E3、2I-14、8I-7、MF4)在55kDa、30kDa附近均檢測到cTnIR146W-EGFP、內(nèi)源性cTnI表達，在28kDa可見cTnI降解條帶，對照組在30kDa可見cTnI表達，未見降解條帶；內(nèi)源性cTnI表達半定量結(jié)果顯示，HCM組抗體3E3檢測明顯高于對照組(P＜0.05

17、)，抗體2I-14、8I-7、MF4檢測兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)。 8.與正常對照組比較，異丙基腎上腺素10-5mol/L、10-4mol/L干預培養(yǎng)SD大鼠心肌細胞72h后，培養(yǎng)上清cTnI的濃度顯著高于對照組(P均＜0.01)，兩組不同ISO濃度干預組之間比較無明顯差異(P＞0.05)；缺血缺氧2h、4h、6h后，培養(yǎng)上清cTnI的濃度均顯著高于對照組(P均＜0.01)；缺血缺氧6h組明顯高于缺血缺氧2h組