人管家基因RNA降解規(guī)律與血痕陳舊度推斷的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　以人離體血痕為研究對象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究不同管家基因RNA隨時(shí)間降解規(guī)律，建立GAPDH mRNA和18s rRNA相對含量變化與血痕陳舊度的回歸方程，并試圖建立標(biāo)準(zhǔn)化的RNA提取與定量檢測方法，希望能最終用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中。
　　方法:
　　1、RNA提取方法的研究：選取6個(gè)血痕樣本，分別用TRIzol法和硅膠柱純化法提取RNA，通過紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA定量和檢測其完整

2、性。并用TRIzol法同時(shí)提取DNA，對DNA進(jìn)行STR分型檢測。
　　2、GAPDH mRNA降解規(guī)律與引物位置、溫度的相關(guān)性研究：在溫度25℃、濕度50％環(huán)境條件下對GAPDH mRNA的4個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)（0d、3d、6d、9d、12d）的實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR檢測，這些位點(diǎn)依次分布于GAPDH mRNA的5′端～3′端，驗(yàn)證mRNA降解可能從5′端向3′端進(jìn)行的假說；在溫度20℃、濕度50％環(huán)境條件下對GAPDH

3、 mRNA的2個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)（0d、3d、6d、9d、12d）的實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR檢測，分析溫度對GAPDH mRNA降解的影響。
　　3、不同管家基因RNA相對定量策略進(jìn)行血痕陳舊度推斷的進(jìn)一步研究：模擬法醫(yī)學(xué)真實(shí)物證現(xiàn)場，在室內(nèi)溫度是（26±2）℃、濕度大約40％即不受控條件下應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測GAPDH mRNA和18s rRNA相對含量隨時(shí)間（0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d）

4、的變化規(guī)律，盡可能消除實(shí)驗(yàn)誤差，探討其與血痕陳舊度的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、采用TRIzol法和硅膠柱純化法提取RNA提取的總RNA純度和得率均可滿足實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)果無顯著性差異（p＞0.05）。對TRIzol法同時(shí)提取的DNA進(jìn)行STR分型檢測，可以得到理想的STR分型圖譜。
　　2、在溫度25℃、濕度50％環(huán)境條件下，經(jīng)線性回歸分析，血痕中各位點(diǎn)GAPDH mRNA均隨時(shí)間的延長發(fā)生降解，但不同位點(diǎn)的mRNA降解

5、速率不同，靠近5′端的兩個(gè)位點(diǎn)降解速率快于靠近3′端的兩個(gè)位點(diǎn)。在溫度20℃、濕度50％環(huán)境條件下，血痕中所選兩個(gè)位點(diǎn)GAPDH mRNA均隨時(shí)間的延長發(fā)生降解，但與其在25℃環(huán)境條件下相比降解速度變慢。
　　3、在溫度(26±2)℃、濕度大約40％室內(nèi)環(huán)境條件下，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測（0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d）血痕樣本中GAPDH mRNA和18s rRNA含量的變化，建立它們與血痕陳舊度的回歸

6、方程如下：GAPDH mRNA／18s rRNA：Y=-0.0002X2+0.0198X+1.6776，R2=0.9878。
　　結(jié)論:
　　1、在研究人血痕管家基因降解規(guī)律的實(shí)驗(yàn)中，總RNA的提取是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，采用TRIzol法和硅膠柱純化法提取RNA提取的總RNA均可滿足實(shí)驗(yàn)要求，但TRIzol法可以實(shí)現(xiàn)RNA和DNA的同步提取，基于法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案中節(jié)約檢材的需要應(yīng)當(dāng)選用TRIzol法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2