TLRs激動(dòng)劑對(duì)紅外期瘧原蟲發(fā)育的影響與機(jī)制研究.pdf

1、瘧疾是蚊媒傳播的嚴(yán)重危害人類健康的熱帶傳染病，在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率。按蚊叮刺時(shí)將瘧原蟲子孢子注入宿主體內(nèi)，隨后子孢子進(jìn)入血液循環(huán)，并可在數(shù)分鐘后迅速侵入肝細(xì)胞。經(jīng)短暫的紅外期增殖發(fā)育，裂殖子再次進(jìn)入血液循環(huán)、侵入紅細(xì)胞導(dǎo)致瘧疾臨床發(fā)作。瘧原蟲在紅外期的增殖發(fā)育是瘧疾生活史中的重要階段，而阻斷蟲體在肝臟內(nèi)的增殖發(fā)育，即可防止瘧原蟲紅內(nèi)期感染。另外，紅外期休眠子的存在是導(dǎo)致間日瘧原蟲臨床病例復(fù)發(fā)的重要原因。因此，紅外期是制

2、定干預(yù)瘧原蟲感染措施的理想時(shí)期，阻斷紅外期瘧原蟲生長發(fā)育能從源頭控制瘧原蟲的感染。然而，目前尚無有效的紅外期疫苗和預(yù)防藥物，迫切需要新的瘧疾防治手段和策略。 子孢子經(jīng)按蚊叮咬注入宿主后，必須且只有侵入肝細(xì)胞并在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行發(fā)育。鼠瘧在肝細(xì)胞內(nèi)43h后發(fā)育成熟，隨后肝細(xì)胞逐漸破裂并釋放出裂殖子。同樣，人瘧的紅外期周期約為1周～10多天，裂殖子進(jìn)入血液循環(huán)后發(fā)育成紅內(nèi)期瘧原蟲，將不會(huì)再返回肝臟。紅內(nèi)期瘧原蟲能夠反復(fù)感染紅細(xì)胞，宿主能

3、夠產(chǎn)生適應(yīng)性免疫。然而，紅外期是瘧原蟲侵入宿主的早期，周期短暫，宿主不能及時(shí)產(chǎn)生適應(yīng)性免疫，主要依賴天然免疫抑制子孢子入侵肝細(xì)胞。在子孢子侵入過程中，大量的天然免疫細(xì)胞，如DCs、NK、NKT、γδ T等細(xì)胞被激活，通過細(xì)胞毒效應(yīng)或分泌細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α等抑制瘧原蟲子孢子感染肝細(xì)胞，并能夠影響CD4+和CD8+T細(xì)胞對(duì)紅外期瘧原蟲的免疫應(yīng)答類型。因此，天然免疫對(duì)抑制紅外期瘧原蟲發(fā)育十分重要，探討宿主天然免疫抗紅外

4、期瘧原蟲機(jī)制是制定新的瘧疾防治措施的前提。 TLRs(Toll-like receptors)受體是天然免疫細(xì)胞的重要模式識(shí)別分子，其介導(dǎo)的信號(hào)是天然免疫的重要組成部分。不同的TLRs能識(shí)別不同的病原體成分，如TLR2識(shí)別脂蛋白(Lipoprotein)、磷壁酸(Lipoteinchoic acid，LTA)和酵母聚糖(Zymosan)，TLR3識(shí)別病毒dsRNA，TLR4識(shí)別脂多糖(LPS)，TLR5識(shí)別鞭毛蛋白(Flage

5、llin)，TLR7/8識(shí)別小分子化合物如咪喹莫特(Imiquimod)和單鏈RNA，而TLR9特異性識(shí)別細(xì)菌DNA中的非甲基化CpG-ODN序列。TLRs表達(dá)于多種天然免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，DC細(xì)胞，B細(xì)胞等。這些天然免疫細(xì)胞能在感染早期通過TLRs受體識(shí)別入侵的病原體而被活化，進(jìn)而激活NF-κB和轉(zhuǎn)錄因子AP-1，促進(jìn)IL-12、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的大量分泌，從而抑制病原體的增殖和擴(kuò)散。研究證實(shí)，TLRs信號(hào)

6、通路提前活化后能有效地抑制弓形蟲、細(xì)菌和病毒的感染。然而，目前還沒有資料顯示提前活化TLRs信號(hào)通路能否影響且有效抑制紅外期瘧原蟲的增殖與發(fā)育。 本研究通過約氏瘧原蟲-BABL/c小鼠模型，以肝臟蟲荷和原蟲血癥為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)不同TLRs激動(dòng)劑在紅外期瘧原蟲增殖發(fā)育中的作用進(jìn)行研究。其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下四個(gè)方面： 一、構(gòu)建約氏瘧原蟲BY265株18S rRNA重組質(zhì)粒：通過對(duì)多種瘧原蟲18S rRNA基因的生物信息

7、學(xué)分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)P.y.BY265株18S rRNA的特異性引物并進(jìn)行分子克隆。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示該片段長度為839bp，經(jīng)Blast分析發(fā)現(xiàn)它與約氏瘧原蟲17XNL株相似性為98％。 二、構(gòu)建Real-time PCR紅外期瘧原蟲檢測(cè)平臺(tái)：在P.v.BY265株18S rRNA重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Real-time PCR特異性的引物和TaqMan探針，并與小鼠GAPDH特異性的Real-time PCR引物和Ta

8、qMan探針共同組成紅外期瘧原蟲Real-time PCR檢測(cè)平臺(tái)。以約氏瘧原蟲-BABL/c小鼠模型，通過對(duì)50、100、500和1000個(gè)唾液腺子孢子感染小鼠的肝臟蟲荷進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示Real-time PCR檢測(cè)平臺(tái)能夠檢測(cè)到最低為50個(gè)子孢子劑量感染的小鼠肝臟蟲荷。 三、以Real-time PCR為基礎(chǔ)，系統(tǒng)的對(duì)不同TLRs激動(dòng)劑在紅外期瘧原蟲增殖發(fā)育中的作用和影響進(jìn)行了研究：在單個(gè)TLRs激動(dòng)劑尾靜脈注入小鼠2

9、4h后，將100個(gè)成熟的唾液腺子孢子再注入小鼠，部分小鼠在瘧原蟲感染后42h取出肝臟進(jìn)行Real-timePCR分析，部分小鼠在瘧原蟲感染后4～14天內(nèi)進(jìn)行原蟲血癥檢查。結(jié)果顯示，在該劑量下部分TLRs激動(dòng)劑能夠顯著抑制紅外期瘧原蟲的發(fā)育，而部分TLRs激動(dòng)劑對(duì)紅外期瘧原蟲的發(fā)育無顯著影響，反而對(duì)紅內(nèi)期的瘧原蟲發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用： 1.在等量TLRs激動(dòng)劑的作用下，TLR2、TLR3、TLR4和TLR9激動(dòng)劑能夠顯著減少小鼠

10、的肝臟蟲荷，其中以TLR9激動(dòng)劑的作用最強(qiáng)，不僅能夠?qū)?00個(gè)唾液腺子孢子感染小鼠的肝臟蟲荷減少約90％，而且還能推遲紅內(nèi)期原蟲血癥的出現(xiàn)。當(dāng)增加瘧原蟲子孢子感染劑量后，肝臟蟲荷和原蟲血癥均有一定的增高，但與對(duì)照組相比，TLR9激動(dòng)劑均能顯著減少肝臟蟲荷及延遲原蟲血癥發(fā)生。因此，活化TLR9信號(hào)通路誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在抑制紅外期瘧原蟲增殖發(fā)育中具有重要的作用。 2.與其它激動(dòng)劑相同劑量的TLR5和TLR7激動(dòng)劑對(duì)瘧原蟲感染小鼠的肝臟

11、蟲荷變化無顯著影響。然而，原蟲血癥結(jié)果顯示，TLR5激動(dòng)劑處理組小鼠的紅內(nèi)期原蟲血癥在感染8天后高于對(duì)照組，提示激活TLR5信號(hào)通路可能有利于紅內(nèi)期瘧原蟲的增殖發(fā)育。 四、探討TLR9激動(dòng)劑和TLR5激動(dòng)劑影響瘧原蟲發(fā)育的免疫機(jī)制： 1.TLR9激動(dòng)劑與枯否細(xì)胞：枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KC)是瘧原蟲子孢子侵入肝細(xì)胞的重要門戶。在氯化釓(GdCl3)特異性阻斷KC的吞噬功能后，TLR9激動(dòng)劑抑制紅外期瘧原蟲

12、發(fā)育的功能顯著下降，提示TLR9激動(dòng)劑通過增強(qiáng)KC細(xì)胞吞噬功能抑制紅外期瘧原蟲的發(fā)育；然而，GdCl3無法完全消除TLR9激動(dòng)劑的抑制作用，提示TLR9激動(dòng)劑還能激活其它的抗瘧原蟲免疫機(jī)制。 2.TLR9激動(dòng)劑與肝臟細(xì)胞因子：細(xì)胞因子是重要的抗瘧原蟲效應(yīng)分子。本課題在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，TLR9激動(dòng)劑能夠上調(diào)肝臟內(nèi)促炎癥因子IFN-γ、IL-12、TNF-α基因的mRNA表達(dá)，而下調(diào)抗炎癥因子IL-10和TGF-β基因的mRNA表

13、達(dá)，提示TLR9激動(dòng)劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟細(xì)胞因子抑制紅外期瘧原蟲的發(fā)育。 3.TLR5激動(dòng)劑與紅內(nèi)期瘧原蟲：將TLR5重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞及其裂解物分別刺激后，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的熒光相對(duì)比值顯著增高，且完整的感染紅細(xì)胞刺激組顯著高于其裂解物刺激組，提示瘧原蟲感染的紅細(xì)胞能夠激活TLR5信號(hào)通路及感染的紅細(xì)胞膜上可能存在TLR5的配體。根據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)，該配體可能通過活化TLR5信號(hào)通路

14、激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)從而降低機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答。 本課題通過建立有效的紅外期瘧原蟲定量檢測(cè)平臺(tái)，系統(tǒng)觀察提前24h激活TLRs信號(hào)通路對(duì)紅外期瘧原蟲發(fā)育的影響。TLR2、TLR3、TLR4和TLR9激動(dòng)劑能夠顯著抑制紅外期瘧原蟲的發(fā)育，其中TLR9激動(dòng)劑抑制作用最強(qiáng)，能夠顯著抑制瘧原蟲感染小鼠的肝臟蟲荷并推遲原蟲血癥的出現(xiàn)。深入研究發(fā)現(xiàn)TLR9激動(dòng)劑通過增強(qiáng)KC細(xì)胞吞噬功能和誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟細(xì)胞因子等免疫效應(yīng)抑制紅外期瘧