約氏瘧原蟲紅外期感染小鼠模型的建立及感染肝細胞miRNA表達譜分析.pdf

1、瘧疾仍然是嚴重危害人類身體健康和生命安全的寄生蟲疾病。瘧原蟲抗藥性和蚊媒對殺蟲劑抗性的出現(xiàn)和擴散使瘧疾流行形勢進一步惡化。目前瘧疾防治迫切需要新的技術(shù)、方法和策略。防治技術(shù)突破的重要基礎是需要對病原體生物學的深刻理解以及病原體與宿主相互作用的功能分子發(fā)現(xiàn)和應用。瘧原蟲生活史復雜，包括了蚊體內(nèi)發(fā)育階段（蚊期）和脊椎動物體內(nèi)發(fā)育階段，其中在脊椎動物體內(nèi)又可分為肝細胞內(nèi)發(fā)育階段（紅外期或肝期）和紅細胞內(nèi)發(fā)育階段（紅內(nèi)期）。瘧原蟲子孢子經(jīng)按蚊叮

2、咬進入脊椎動物體內(nèi)，首先侵入肝實質(zhì)細胞并在其中進行裂體增殖，產(chǎn)生的裂殖子釋放入血并感染紅細胞。雖然紅內(nèi)期是瘧原蟲主要致病階段，而肝期（紅外期）發(fā)育不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但是肝期是瘧原蟲在脊椎動物中建立感染的首要階段。因此，阻斷瘧原蟲對肝細胞的入侵或在其中的生長發(fā)育，就可以有效阻斷感染，是新型防治技術(shù)研發(fā)的重要靶點。由于瘧原蟲紅外期研究材料獲得的限制，以往瘧疾研究大多以紅內(nèi)期原蟲為研究對象。近年來，多種新技術(shù)的開發(fā)和應用使得我們能夠?qū)Ο懺x

3、肝期發(fā)育階段開展更為深入的研究。
　　 瘧原蟲與宿主相互作用及其細胞和分子機制研究，一直是瘧原蟲生物學研究領域的重點、熱點，也是發(fā)展新的藥物、疫苗和瘧疾防治策略的基礎。同樣，在肝期瘧原蟲與宿主相互作用中的關鍵性因子及其對肝期瘧原蟲生長發(fā)育的作用也是研究的熱點。目前，相關研究進展主要集中在發(fā)現(xiàn)一些蟲源性或宿主來源的分子及其對肝期瘧原蟲發(fā)育繁殖的作用。而現(xiàn)今生命科學研究熱點之一的miRNA及其對瘧原蟲生長發(fā)育的影響只有少量研究報道。

4、
　　 miRNA是一類非編碼小RNA分子，長度為18-22個核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因功能，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導、腫瘤發(fā)生等過程的調(diào)控。新進的報道表明，頂復門原蟲可以干預宿主細胞miRNA表達，通過RNAi沉默分子通路，改變宿主細胞內(nèi)的環(huán)境，滿足其生長發(fā)育的需要或抵抗來自宿主的免疫攻擊。瘧原蟲自身不表達miRNA，有報道顯示宿主來源的miRNA對紅內(nèi)期瘧原蟲感染和致病有影響，但宿主肝細胞miRNA對肝期

5、瘧原蟲的作用尚未有報道。對此，為研究宿主肝臟細胞miRNA對肝期瘧原蟲生長發(fā)育繁殖的影響，本課題首先采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達表達綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因瘧原蟲;利用該轉(zhuǎn)基因蟲株，建立了瘧原蟲整個生活史的實驗模型。通過子孢子的感染，采用流式分選高純度陽性肝實質(zhì)細胞，并以此為材料采用低密度芯片檢測并分析了感染肝細胞miRNA表達譜的變化，具體方法和結(jié)果如下:
　　 1.為了采用流式技術(shù)快速分選感染瘧原蟲的宿主

6、肝細胞，我們構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達GFP的約氏瘧原蟲(PyGFP)。采用AMAXA Nucleofactor技術(shù)，將線性化的同源重組質(zhì)粒pL0016轉(zhuǎn)染約氏瘧原蟲BY265株。該質(zhì)粒包含有g(shù)fp基因、驅(qū)動GFP表達的持家基因伯氏瘧原蟲翻譯延長因子1α（pbef1αa）的啟動子、用于藥物篩選的乙胺嘧啶抗性基因以及伯氏瘧原蟲SSu-rrna基因。由于伯氏瘧原蟲與約氏瘧原蟲的ssu-rrna具有96％同源性，因此質(zhì)粒與瘧原蟲基因組可發(fā)生同

7、源整合。轉(zhuǎn)染后，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)得到了正確整合的轉(zhuǎn)基因PyGFP蟲株和野生蟲株的混合群體。采用有限稀釋法進行蟲株克隆，獲得了1個轉(zhuǎn)基因PyGFP的單克隆品系。熒光顯微鏡檢查顯示，該單克隆品系原蟲發(fā)出綠色熒光。通過特異性引物PCR鑒定確認該克隆原蟲基因組中發(fā)生了正確整合，且無野生蟲株的污染。
　　 2.建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP整個生活史的實驗模型。PyGFP接種昆明鼠3天后，斯氏按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。感染后第7天和第16天，

8、解剖蚊胃和唾液腺，觀察到發(fā)出綠色熒光的胃壁卵囊和唾液腺。再以陽性按蚊叮咬昆明鼠，7天后觀察到發(fā)出綠色熒光的紅內(nèi)期瘧原蟲。由此表明已成功建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP整個生活史的實驗模型，且各期原蟲均表達GFP。在此基礎上，我們從兩方面對該模型進行了優(yōu)化:(1)優(yōu)化PyGFP對斯氏按蚊的感染。以不同劑量PyGFP原蟲腹腔注射昆明鼠，3天后按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。按蚊感染后第7天，用熒光顯微鏡計數(shù)胃壁卵囊數(shù)。結(jié)果顯示，1×107，5×106和

9、1×106三個劑量組卵囊數(shù)無統(tǒng)計學差異，各組50％以上按蚊卵囊數(shù)在100-500之間，平均89個;但5×105劑量組，卵囊數(shù)平均59個，與以上三組均有統(tǒng)計學差異。小鼠初始轉(zhuǎn)種量以每鼠1×106-1×107個紅內(nèi)期PyGFP原蟲為最佳。(2)優(yōu)化PyGFP子孢子對小鼠肝細胞的感染。為獲得高感染效力的子孢子，我們比較了在按蚊感染后不同時間點的子孢子對肝細胞的感染率。將分離的子孢子通過尾靜脈注入BALB/c小鼠，40h后制備肝臟單細胞懸液，經(jīng)

10、流式檢測，計算肝細胞感染率。結(jié)果顯示按蚊感染后第23天分離的子孢子感染效力最強，其宿主肝細胞感染率可達0.083％。
　　 3.感染PyGFP肝細胞分選:采用上述優(yōu)化的蚊期和紅外期感染模型，在斯氏按蚊感染后第23天以不連續(xù)密度梯度法離心分離唾液腺子孢子，計數(shù)子孢子數(shù)。300-800萬個子孢子經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠，即為實驗組;正常斯氏按蚊經(jīng)同樣實驗處理后，將獲得的無子孢子緩沖液尾靜脈注射BALB/c小鼠，即為對照組。40h

11、后，用一步膠原酶灌注消化法制備小鼠肝臟單細胞懸液;流式細胞儀分選肝細胞，先在前向角散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC)散點圖中圈定肝實質(zhì)細胞群;再以對照組細胞在前向角散射(FSC)和熒光FITC散點圖中的分布，劃定正常肝細胞熒光閾值范圍;實驗組中超出閾值的則為陽性感染細胞。經(jīng)流式分選每只感染小鼠可獲得4000-17000個陽性肝細胞。同時分選對照組肝細胞為對照組
　　 4.感染瘧原蟲肝細胞miRNA表達譜的分析:由于獲得感染肝細

12、胞數(shù)量少，得到的總RNA量較低，難以滿足常用的MicroRNA芯片、RNA-Seq等方法對總RNA量的需求，因此我們選擇了敏感性和特異性都較高且對RNA總量需求較少的TaqMANMicroRNA Array低密度芯片，檢測miRNA表達譜變化。以感染后40h的BALB/c小鼠肝臟為實驗組，檢測2個樣本;以正常斯氏按蚊經(jīng)同樣實驗處理后，將獲得的無子孢子緩沖液尾靜脈注射BALB/c小鼠，其肝細胞為對照組，檢測1個樣本。芯片檢測獲得各組各個m

13、iRNA的Ct值，以小鼠snoRNA202為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計學分析，實驗組與對照組存在顯著性差異。與正常肝細胞相比，感染肝細胞中有29條miRNA差異表達在3倍以上。其中miR-101a、miR-152、miR-21、miR-122、miR-222、miR-92a、miR-29c、miR-142-3p等17條miRNA表達升高在5倍以上。經(jīng)統(tǒng)計學分析，這些miRNA在實驗組與對照組之間有顯著性差異。為驗證這些改變

14、的miRNA，我們采用SYBR Green Real Time PCR法對其中10條miRNA(miR-152、miR-101a、miR-142-3p、miR-122、miR-222、miR-125a-5p、miR-21、miR-29c、miR-19a、1et-7c)進行驗證。結(jié)果顯示:驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果比較，這10條miRNA表達變化趨勢基本一致，但倍數(shù)變化不完全相同。為探討差異表達miRNA在瘧原蟲紅前期的作用，我們對差異表達1

15、0倍以上的8條miRNA進行生物信息學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶基因顯著分布于TGF-β信號通路，且涉及多種TGF-β相關分子功能。以往研究發(fā)現(xiàn):TGF-β通過SMAD信號通路上調(diào)miR-21表達，抑制細胞凋亡。同時瘧原蟲有抑制寄生細胞凋亡的生命現(xiàn)象。因此，我們欲從此方向出發(fā)開展下一步實驗研究。
　　 小結(jié):
　　 本研究構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達GFP的轉(zhuǎn)基因PyGFP蟲株，建立了該蟲株感染小鼠→按蚊→小鼠完整的生活史動物模型