約氏瘧原蟲(chóng)紅外期感染小鼠模型的建立及感染肝細(xì)胞miRNA表達(dá)譜分析.pdf

1、瘧疾仍然是嚴(yán)重危害人類身體健康和生命安全的寄生蟲(chóng)疾病。瘧原蟲(chóng)抗藥性和蚊媒對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的出現(xiàn)和擴(kuò)散使瘧疾流行形勢(shì)進(jìn)一步惡化。目前瘧疾防治迫切需要新的技術(shù)、方法和策略。防治技術(shù)突破的重要基礎(chǔ)是需要對(duì)病原體生物學(xué)的深刻理解以及病原體與宿主相互作用的功能分子發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。瘧原蟲(chóng)生活史復(fù)雜，包括了蚊體內(nèi)發(fā)育階段（蚊期）和脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育階段，其中在脊椎動(dòng)物體內(nèi)又可分為肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)育階段（紅外期或肝期）和紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育階段（紅內(nèi)期）。瘧原蟲(chóng)子孢子經(jīng)按蚊叮

2、咬進(jìn)入脊椎動(dòng)物體內(nèi)，首先侵入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞并在其中進(jìn)行裂體增殖，產(chǎn)生的裂殖子釋放入血并感染紅細(xì)胞。雖然紅內(nèi)期是瘧原蟲(chóng)主要致病階段，而肝期（紅外期）發(fā)育不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但是肝期是瘧原蟲(chóng)在脊椎動(dòng)物中建立感染的首要階段。因此，阻斷瘧原蟲(chóng)對(duì)肝細(xì)胞的入侵或在其中的生長(zhǎng)發(fā)育，就可以有效阻斷感染，是新型防治技術(shù)研發(fā)的重要靶點(diǎn)。由于瘧原蟲(chóng)紅外期研究材料獲得的限制，以往瘧疾研究大多以紅內(nèi)期原蟲(chóng)為研究對(duì)象。近年來(lái)，多種新技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用使得我們能夠?qū)Ο懺x(chóng)

3、肝期發(fā)育階段開(kāi)展更為深入的研究。
　　 瘧原蟲(chóng)與宿主相互作用及其細(xì)胞和分子機(jī)制研究，一直是瘧原蟲(chóng)生物學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)、熱點(diǎn)，也是發(fā)展新的藥物、疫苗和瘧疾防治策略的基礎(chǔ)。同樣，在肝期瘧原蟲(chóng)與宿主相互作用中的關(guān)鍵性因子及其對(duì)肝期瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的作用也是研究的熱點(diǎn)。目前，相關(guān)研究進(jìn)展主要集中在發(fā)現(xiàn)一些蟲(chóng)源性或宿主來(lái)源的分子及其對(duì)肝期瘧原蟲(chóng)發(fā)育繁殖的作用。而現(xiàn)今生命科學(xué)研究熱點(diǎn)之一的miRNA及其對(duì)瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響只有少量研究報(bào)道。

4、
　　 miRNA是一類非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度為18-22個(gè)核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因功能，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生等過(guò)程的調(diào)控。新進(jìn)的報(bào)道表明，頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)可以干預(yù)宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)，通過(guò)RNAi沉默分子通路，改變宿主細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，滿足其生長(zhǎng)發(fā)育的需要或抵抗來(lái)自宿主的免疫攻擊。瘧原蟲(chóng)自身不表達(dá)miRNA，有報(bào)道顯示宿主來(lái)源的miRNA對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)感染和致病有影響，但宿主肝細(xì)胞miRNA對(duì)肝期

5、瘧原蟲(chóng)的作用尚未有報(bào)道。對(duì)此，為研究宿主肝臟細(xì)胞miRNA對(duì)肝期瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育繁殖的影響，本課題首先采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng);利用該轉(zhuǎn)基因蟲(chóng)株，建立了瘧原蟲(chóng)整個(gè)生活史的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｍㄟ^(guò)子孢子的感染，采用流式分選高純度陽(yáng)性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并以此為材料采用低密度芯片檢測(cè)并分析了感染肝細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的變化，具體方法和結(jié)果如下:
　　 1.為了采用流式技術(shù)快速分選感染瘧原蟲(chóng)的宿主

6、肝細(xì)胞，我們構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達(dá)GFP的約氏瘧原蟲(chóng)(PyGFP)。采用AMAXA Nucleofactor技術(shù)，將線性化的同源重組質(zhì)粒pL0016轉(zhuǎn)染約氏瘧原蟲(chóng)BY265株。該質(zhì)粒包含有g(shù)fp基因、驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的持家基因伯氏瘧原蟲(chóng)翻譯延長(zhǎng)因子1α（pbef1αa）的啟動(dòng)子、用于藥物篩選的乙胺嘧啶抗性基因以及伯氏瘧原蟲(chóng)SSu-rrna基因。由于伯氏瘧原蟲(chóng)與約氏瘧原蟲(chóng)的ssu-rrna具有96％同源性，因此質(zhì)粒與瘧原蟲(chóng)基因組可發(fā)生同

7、源整合。轉(zhuǎn)染后，經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)得到了正確整合的轉(zhuǎn)基因PyGFP蟲(chóng)株和野生蟲(chóng)株的混合群體。采用有限稀釋法進(jìn)行蟲(chóng)株克隆，獲得了1個(gè)轉(zhuǎn)基因PyGFP的單克隆品系。熒光顯微鏡檢查顯示，該單克隆品系原蟲(chóng)發(fā)出綠色熒光。通過(guò)特異性引物PCR鑒定確認(rèn)該克隆原蟲(chóng)基因組中發(fā)生了正確整合，且無(wú)野生蟲(chóng)株的污染。
　　 2.建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP整個(gè)生活史的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀yGFP接種昆明鼠3天后，斯氏按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。感染后第7天和第16天，

8、解剖蚊胃和唾液腺，觀察到發(fā)出綠色熒光的胃壁卵囊和唾液腺。再以陽(yáng)性按蚊叮咬昆明鼠，7天后觀察到發(fā)出綠色熒光的紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)。由此表明已成功建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP整個(gè)生活史的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，且各期原蟲(chóng)均表達(dá)GFP。在此基礎(chǔ)上，我們從兩方面對(duì)該模型進(jìn)行了優(yōu)化:(1)優(yōu)化PyGFP對(duì)斯氏按蚊的感染。以不同劑量PyGFP原蟲(chóng)腹腔注射昆明鼠，3天后按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。按蚊感染后第7天，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)胃壁卵囊數(shù)。結(jié)果顯示，1×107，5×106和

9、1×106三個(gè)劑量組卵囊數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組50％以上按蚊卵囊數(shù)在100-500之間，平均89個(gè);但5×105劑量組，卵囊數(shù)平均59個(gè)，與以上三組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小鼠初始轉(zhuǎn)種量以每鼠1×106-1×107個(gè)紅內(nèi)期PyGFP原蟲(chóng)為最佳。(2)優(yōu)化PyGFP子孢子對(duì)小鼠肝細(xì)胞的感染。為獲得高感染效力的子孢子，我們比較了在按蚊感染后不同時(shí)間點(diǎn)的子孢子對(duì)肝細(xì)胞的感染率。將分離的子孢子通過(guò)尾靜脈注入BALB/c小鼠，40h后制備肝臟單細(xì)胞懸液，經(jīng)

10、流式檢測(cè)，計(jì)算肝細(xì)胞感染率。結(jié)果顯示按蚊感染后第23天分離的子孢子感染效力最強(qiáng)，其宿主肝細(xì)胞感染率可達(dá)0.083％。
　　 3.感染PyGFP肝細(xì)胞分選:采用上述優(yōu)化的蚊期和紅外期感染模型，在斯氏按蚊感染后第23天以不連續(xù)密度梯度法離心分離唾液腺子孢子，計(jì)數(shù)子孢子數(shù)。300-800萬(wàn)個(gè)子孢子經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠，即為實(shí)驗(yàn)組;正常斯氏按蚊經(jīng)同樣實(shí)驗(yàn)處理后，將獲得的無(wú)子孢子緩沖液尾靜脈注射BALB/c小鼠，即為對(duì)照組。40h

11、后，用一步膠原酶灌注消化法制備小鼠肝臟單細(xì)胞懸液;流式細(xì)胞儀分選肝細(xì)胞，先在前向角散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC)散點(diǎn)圖中圈定肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞群;再以對(duì)照組細(xì)胞在前向角散射(FSC)和熒光FITC散點(diǎn)圖中的分布，劃定正常肝細(xì)胞熒光閾值范圍;實(shí)驗(yàn)組中超出閾值的則為陽(yáng)性感染細(xì)胞。經(jīng)流式分選每只感染小鼠可獲得4000-17000個(gè)陽(yáng)性肝細(xì)胞。同時(shí)分選對(duì)照組肝細(xì)胞為對(duì)照組
　　 4.感染瘧原蟲(chóng)肝細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的分析:由于獲得感染肝細(xì)

12、胞數(shù)量少，得到的總RNA量較低，難以滿足常用的MicroRNA芯片、RNA-Seq等方法對(duì)總RNA量的需求，因此我們選擇了敏感性和特異性都較高且對(duì)RNA總量需求較少的TaqMANMicroRNA Array低密度芯片，檢測(cè)miRNA表達(dá)譜變化。以感染后40h的BALB/c小鼠肝臟為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)2個(gè)樣本;以正常斯氏按蚊經(jīng)同樣實(shí)驗(yàn)處理后，將獲得的無(wú)子孢子緩沖液尾靜脈注射BALB/c小鼠，其肝細(xì)胞為對(duì)照組，檢測(cè)1個(gè)樣本。芯片檢測(cè)獲得各組各個(gè)m

13、iRNA的Ct值，以小鼠snoRNA202為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異。與正常肝細(xì)胞相比，感染肝細(xì)胞中有29條miRNA差異表達(dá)在3倍以上。其中miR-101a、miR-152、miR-21、miR-122、miR-222、miR-92a、miR-29c、miR-142-3p等17條miRNA表達(dá)升高在5倍以上。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，這些miRNA在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有顯著性差異。為驗(yàn)證這些改變

14、的miRNA，我們采用SYBR Green Real Time PCR法對(duì)其中10條miRNA(miR-152、miR-101a、miR-142-3p、miR-122、miR-222、miR-125a-5p、miR-21、miR-29c、miR-19a、1et-7c)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示:驗(yàn)證結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果比較，這10條miRNA表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，但倍數(shù)變化不完全相同。為探討差異表達(dá)miRNA在瘧原蟲(chóng)紅前期的作用，我們對(duì)差異表達(dá)1

15、0倍以上的8條miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶基因顯著分布于TGF-β信號(hào)通路，且涉及多種TGF-β相關(guān)分子功能。以往研究發(fā)現(xiàn):TGF-β通過(guò)SMAD信號(hào)通路上調(diào)miR-21表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)瘧原蟲(chóng)有抑制寄生細(xì)胞凋亡的生命現(xiàn)象。因此，我們欲從此方向出發(fā)開(kāi)展下一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　 小結(jié):
　　 本研究構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因PyGFP蟲(chóng)株，建立了該蟲(chóng)株感染小鼠→按蚊→小鼠完整的生活史動(dòng)物模型