紫外誘導(dǎo)圓錐鐵線蓮次生代謝擾動(dòng)的調(diào)控機(jī)制研究及香豆素合成酶PPO的克隆與表達(dá).pdf

1、中藥和天然藥物有效成分含量偏低是限制中醫(yī)藥發(fā)展的關(guān)鍵因素。近年來(lái)，通過(guò)改良道地藥材品質(zhì)、改善藥材種植環(huán)境等優(yōu)化措施，中藥材品質(zhì)逐年提升。我們研究組運(yùn)用紫外誘導(dǎo)技術(shù)，能顯著提高藥用植物中有效成分的含量，為提高藥材品質(zhì)提供了新的方法。植物響應(yīng)紫外誘導(dǎo)的方式，主要體現(xiàn)為吸收紫外光次生代謝物的形成和積累。這些次生代謝產(chǎn)物多數(shù)為中藥有效成分，包括黃酮、香豆素、蒽醌、萜類、生物堿等。
　　圓錐鐵線蓮是浙北地區(qū)抗腫瘤和治療慢性前列腺炎的常用中藥

2、，療效肯定，但有效成分含量偏低，嚴(yán)重影響了圓錐鐵線蓮的推廣和開發(fā)應(yīng)用。前期我們對(duì)圓錐鐵線蓮響應(yīng)紫外誘導(dǎo)以及暗培養(yǎng)(HUVB+D)代謝擾動(dòng)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)在雙重脅迫下圓錐鐵線蓮的生理狀態(tài)及一系列次生代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化和積累。有效成分含量顯著增加，分析證明香豆素類化合物是擾動(dòng)的次生代謝物中主要成分，主要包括10-demethyl-luvangeti、4，6，7-trimethoxy-5-methyl-2H-chromen-2-one

3、和luvangetin。研究組進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是香豆素基本結(jié)構(gòu)七葉亭生物合成的關(guān)鍵酶，主要催化咖啡酸側(cè)鏈的內(nèi)酯化而形成七葉亭。本文在上述研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)圓錐鐵線蓮HUVB+D下次生代謝物擾動(dòng)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，并對(duì)香豆素生物合成途徑的關(guān)鍵酶PPO進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析。本課題的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)紫外誘導(dǎo)圓錐鐵線蓮次生代謝擾動(dòng)的調(diào)控機(jī)制研究

4、　　本文主要以代謝組學(xué)技術(shù)，并結(jié)合qRT-PCR、激素含量測(cè)定、生理指標(biāo)以及酶活檢測(cè)等技術(shù)手段，對(duì)HUVB+D脅迫下圓錐鐵線蓮中次生代謝擾動(dòng)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。qRT-PCR顯示在HUVB+D下UVR8(UV resistance locus8)初始信號(hào)通路被激活。激素水平以及其生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)量和中間產(chǎn)物含量測(cè)定顯示茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)信號(hào)通路亦被激活?；贕C-MS的代謝組學(xué)分析顯示，HUVB+D脅迫處理后氨基

5、酸代謝、碳水化合物代謝、有機(jī)酸代謝以及脂質(zhì)代謝均有所增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)照組(CG)、JA富集組(JG)、JA抑制組(IG)中差異變化代謝物聚類以及KEGG代謝通路分析，顯示HUVB+D脅迫后JG中咖啡酸和二氫香豆素類次生代謝物的含量大于CG和IG，而JG中脯氨酸的含量小于CG和IG;谷氨酸脫氫酶酶活檢測(cè)結(jié)果顯示JA可以增加氮源到碳源的轉(zhuǎn)化率。上述結(jié)果表明，圓錐鐵線蓮在HUVB+D下UVR8初始信號(hào)通路被激活，并進(jìn)一步激活了JA和SA信號(hào)通路;

6、JA和SA通過(guò)調(diào)節(jié)碳氮轉(zhuǎn)化分別增加次生代謝物和脯氨酸的含量來(lái)降低HUVB+D脅迫下活性氧的水平，從而起到協(xié)調(diào)保護(hù)作用，增強(qiáng)了植物的脅迫耐受性。
　　(2)圓錐鐵線蓮多酚氧化酶的克隆和表達(dá)
　　通過(guò)分析圓錐鐵線蓮中多酚氧化酶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RACE得到的序列片段，結(jié)合本研究中g(shù)enome walking技術(shù)，得到了總長(zhǎng)度為1975bp的多酚氧化酶的堿基序列，其中包含長(zhǎng)度為590個(gè)氨基酸的完整ORF區(qū)。對(duì)該序列所編碼的蛋白進(jìn)行理化性

7、質(zhì)預(yù)測(cè)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，預(yù)測(cè)圓錐鐵線蓮PPO分子量為66.32kD、是位于葉綠體中不穩(wěn)定的親水性蛋白，且與荷花PPO親緣關(guān)系最近。通過(guò)構(gòu)建pET-28a(+)-CtPPO重組蛋白并在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG法誘導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)分析確認(rèn)在28℃、180rpm、0.8mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h條件下目的蛋白的表達(dá)量最高，并且在上清和沉淀中均有表達(dá)，且較多部分以包涵體形式存在。通過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在16℃、18