白木香倍半萜誘導(dǎo)子的篩選與萜類合成酶基因的克隆表達(dá)分析.pdf

1、國產(chǎn)沉香（agarwood、Chinese eaglewood）為瑞香科植物白木香含有黑色樹脂的木質(zhì)部。白木香（Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg）是我國國產(chǎn)沉香的唯一植物資源，健康生長的白木香木質(zhì)柔軟，白色，沒有香氣，只有在受到外界傷害，如自然惡劣條件下的風(fēng)折、雷擊、蟲蛀等刺激和人為條件下的砍傷、接菌等傷害后才能在傷口處分泌黑色樹脂，進(jìn)而形成沉香。
　　沉香的化學(xué)成分主要為倍半萜類、2-（2-苯乙基）色酮

2、類和芳香族類化合物。人工誘導(dǎo)的沉香與天然沉香的化學(xué)組成差異較大，天然沉香中主要成分為倍半萜類化合物和2-（2-苯乙基）色酮類化合物，且含量大致相同；人工沉香中主要為2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)。倍半萜類化合物是白木香處于逆境脅迫狀況下時(shí)產(chǎn)生的防御物質(zhì)，也是沉香的特征性成分和藥理活性成分。篩選白木香倍半萜類成分的誘導(dǎo)子和萜類合成途徑中關(guān)鍵限速酶基因的克隆表達(dá)分析，對于闡明沉香（樹脂）形成的分子機(jī)制、人工誘導(dǎo)結(jié)香過程的調(diào)控和提高人工沉香品質(zhì)

3、具有重要意義。
　　課題組前期野外白木香促香試驗(yàn)研究證明甲酸結(jié)合白木香內(nèi)生真菌 A13為高效的促香誘導(dǎo)子，本文此基礎(chǔ)上，以白木香離體枝條模型為基礎(chǔ)，用誘導(dǎo)子（甲酸、水楊酸、茉莉酸甲酯和白木香內(nèi)生真菌A13）單獨(dú)誘導(dǎo)或做種誘導(dǎo)子綜合刺激誘導(dǎo)，篩選高效、專一誘導(dǎo)白木香萜類合成酶基因的表達(dá)和倍半萜類成分形成的誘導(dǎo)子；采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對離體枝條進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物分析，檢測并鑒定倍半萜類成分；運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分析萜類合成酶基因HM

4、GR和DXS的表達(dá)水平，結(jié)合GC-MS檢測結(jié)果，綜合評價(jià)誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效果，最終確定“1％茉莉酸甲酯加10%A13”和“1%茉莉酸甲酯加15%A13”的誘導(dǎo)子組合可以選擇性地誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生倍半萜類成分。
　　在前期轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，從化學(xué)傷害白木香結(jié)香部位cDNA中克隆得到萜類合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因HMGR，其序列全長為1779bp。將基因片段插入pET22b中構(gòu)建重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)親和層析純化后獲得具有生

5、物活性的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR），經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，Western-blot鑒定，HMGR蛋白以包涵體形式表達(dá)，其蛋白分子量大小為68kD。HMGR蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG濃度為0.5mM，37℃條件下誘導(dǎo)4h。HMGR蛋白包涵體經(jīng)透析復(fù)性后以HMG-CoA為底物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，最終確定在35℃，pH7.0，HMG-CoA濃度為0.1mM時(shí)反應(yīng)4min為最佳酶促反應(yīng)條件。
　　本文結(jié)合白木香