類球紅細(xì)菌自誘導(dǎo)物合成酶基因的克隆、表達(dá)及其蛋白性質(zhì)的研究.pdf

1、細(xì)菌通過產(chǎn)生信號分子來感知環(huán)境中自身與其他細(xì)菌的數(shù)量。當(dāng)信號分子濃度隨細(xì)菌密度的增加達(dá)到一定閥值時，整個細(xì)菌群落就會在群體水平上作出基因表達(dá)的調(diào)整，從而使細(xì)菌作出適應(yīng)環(huán)境的變化，這一系統(tǒng)被稱為群體感應(yīng)(Quorum-sensing，QS)系統(tǒng)。
　　 類球紅細(xì)菌是光合細(xì)菌的主要成員之一，屬于革蘭氏陰性菌，能在多種環(huán)境下生存，在光照厭氧異養(yǎng)條件下可產(chǎn)氫。該菌的cer群體感應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的自誘導(dǎo)物為?；呓z氨酸內(nèi)酯(7,8-cis-N-

2、(tetradecenoyl)homoserine lactone)。
　　 本文根據(jù)GenBank登錄的Rhodobacter sphaeroides2.4.1 cerI編碼序列(GeneID：3719690)設(shè)計(jì)一對特異性的引物，以R.sp基因組為模板，熱啟動PCR方法擴(kuò)增cerI的編碼序列，將擴(kuò)增的片段克隆至原核表達(dá)載體大腸桿菌DH5α pET28a(+)；通過菌落PCR、酶切重組質(zhì)粒和測序鑒定重組質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物純化后，

3、將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)-cerI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測。利用DNASTAR、VectorNTI9.0、Signal、Jpred等生物信息學(xué)平臺對類球紅細(xì)菌自誘導(dǎo)物合成酶進(jìn)行了一級結(jié)構(gòu)、功能域、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析。在數(shù)據(jù)庫(http：//www.ExPaSy.org/)上搜索氨基酸序列同源性大于30％的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，確定三級結(jié)構(gòu)模板，對目的蛋白的三級結(jié)構(gòu)同源建模

4、。通過SWISS-MODEL建模網(wǎng)站搜索到的銅綠假單胞菌自誘導(dǎo)物合成酶的晶體結(jié)構(gòu)作為最佳模板，模建類球紅細(xì)菌CerI的三維結(jié)構(gòu)。
　　 類球紅細(xì)菌自誘導(dǎo)物合成酶蛋白CerI的一級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如下：CerI序列中含有1個自誘導(dǎo)物合成酶標(biāo)志，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，1個蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，3個豆蔻酰化位點(diǎn)。該蛋白不存在信號肽，不是分泌蛋白。對CerI的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明cerI蛋白既有α螺旋存在也有β折疊存在，α螺旋位置主要在

5、第7～26，129～139，175～183等區(qū)段，β折疊位置主要在第65～76，145～158，195～209等氨基酸區(qū)段。通過對CerI蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模發(fā)現(xiàn)，類球紅細(xì)菌的CerI與銅綠假單孢菌的LasI的空間結(jié)構(gòu)相似，它們屬于同一個折疊類型。
　　 通過在類球紅細(xì)菌中加入經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白菌液混合打孔培養(yǎng)，研究了自誘導(dǎo)物合成酶對類球紅細(xì)菌培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明該蛋白可以促進(jìn)對數(shù)期細(xì)菌的趨散生長，同屬細(xì)菌的上清液做為培養(yǎng)