凝血酶切割骨橋蛋白在肝纖維化中的作用研究.pdf

1、肝臟纖維化是由于包括膠原蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的過(guò)度積累所導(dǎo)致的。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分的慢性肝臟疾病。目前，纖維化被認(rèn)為是機(jī)體的一種應(yīng)答反應(yīng)，是機(jī)體對(duì)慢性肝臟疾病導(dǎo)致的肝臟反復(fù)損傷的一個(gè)損傷-修復(fù)反應(yīng)，同時(shí)伴隨修復(fù)和再生的過(guò)程。
　　肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化被作為ECM沉積的中心事件。在細(xì)胞因子刺激之后，靜止的HSCs增殖

2、并轉(zhuǎn)分化為具有促炎和促纖維化功能的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞。而且，活化的HSCs能夠分泌一系列的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，對(duì)于維持HSCs的活化狀態(tài)是有利的。在這些細(xì)胞因子中，TGF-β是肝臟中最有效的致纖維化的細(xì)胞因子，它可以刺激ECM蛋白的合成。目前大量研究證實(shí)HSCs的活化和增值大多是TGFβ依賴(lài)途徑的。
　　全長(zhǎng)OPN（full length OPN，OPN-FL）是一種可溶性的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，也是一種磷酸化糖蛋白。OPN蛋白包含一個(gè)經(jīng)

3、典的與細(xì)胞表面受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域——精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)構(gòu)域（arginine-glycine-aspartic acid, RGD），這個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠被細(xì)胞表面的整合素受體αvβ3，αvβ5，α4β1，andα8β1識(shí)別。這些識(shí)別RGD的整合素可表達(dá)于多種細(xì)胞表面，包括成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。OPN-FL在RGD結(jié)構(gòu)域外臨近的氨基酸序列能夠被凝血酶識(shí)別并切割。OPN-FL被凝血酶切割之后稱(chēng)為凝血酶切割的

4、OPN(Thrombin-cleavedOPN，Thr-OPN)，暴露出了一個(gè)新的整合素受體結(jié)合的位點(diǎn)--SVVYGLR序列（在小鼠中為SLAYGLR)，這個(gè)位點(diǎn)可以被整合素α4β1和α9β1識(shí)別。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分類(lèi)型的慢性肝臟疾病中，包括慢性乙型病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steato

5、hepatitis，NASH)、酒精性肝臟疾病(alcoholic liver disease，ALD)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)。近來(lái)的報(bào)道指出血漿OPN-FL在肝纖維化患者中升高，其升高的水平可以用于預(yù)測(cè)肝硬化的進(jìn)展，并且OPN-FL能夠誘導(dǎo)HSCs的活化。在動(dòng)物模型中OPN的缺乏可以保護(hù)小鼠抵抗肝臟纖維化進(jìn)展?？傊?，OPN參與了大部分類(lèi)型慢性肝臟疾病中肝纖維化的過(guò)程。但是由于

6、OPN可以以多種形式存在于細(xì)胞內(nèi)外，并且能夠與一系列整合素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，具體是哪一種形式的OPN在肝纖維化中發(fā)揮作用，以及通過(guò)哪個(gè)受體發(fā)揮作用是不清楚的。這些都是亟待解決的。
　　Thr-OPN暴露一個(gè)新的整合素結(jié)合位點(diǎn)——SVVYGLR(小鼠中為SLAYGLR)序列，能夠促進(jìn)了表達(dá)整合素α4和α9的細(xì)胞的粘附。近來(lái)的研究表明，Thr-OPN參與了酒精誘導(dǎo)小鼠酒精相關(guān)性肝病模型和ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中肝炎的發(fā)病機(jī)制

7、。另外，也有研究指出Thr-OPN在心肌纖維化模型中促進(jìn)了Ⅲ型膠原蛋白的合成。
　　然而，關(guān)于Thr-OPN在人類(lèi)疾病中的作用研究很少，關(guān)于Thr-OPN在肝硬化中的功能亦知之甚少。因此，本文擬研究Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)情況以及是否明顯參與了肝硬化的進(jìn)展。
　　第一部分:Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)及其對(duì)HSCs的活化和功能影響
　　目的:
　　明確Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)情況，

8、探索Thr-OPN對(duì)HSCs的活化和功能影響。
　　方法:
　　1)通過(guò)收集健康人，慢乙肝患者以及慢乙肝相關(guān)肝纖維化患者樣本，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)其主要Thr-OPN、OPN-FL和TGF-β在肝纖維化患者中的表達(dá)情況。并分別分析Thr-OPN、OPN-FL和血漿中肝纖維化非侵入性指標(biāo)（透明質(zhì)酸，Ⅲ型前膠原和Ⅳ膠原）以及TGF-β之間的相關(guān)性
　　2)利用肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞，并通過(guò)western blot，PCR

9、，ELISA，MTS和微流控系統(tǒng)等方法研究Thr-OPN對(duì)HSCs的活化、增殖、遷移和膠原合成功能影響。
　　結(jié)果:
　　1)肝硬化患者血漿Thr-OPN水平明顯高于慢乙肝和健康志愿者。
　　2)肝硬化患者Thr-OPN的表達(dá)與血漿中肝纖維化非侵入性指標(biāo)透明質(zhì)酸，Ⅲ型前膠原和Ⅳ膠原的水平均呈明顯正相關(guān)，也與TGF-β水平呈明顯的正相關(guān)。
　　3)Thr-OPN能夠活化HSCs，并促進(jìn)其自身分泌TGF-β，有利于H

10、SCs活化狀態(tài)的維持，同時(shí)能夠增強(qiáng)HSCs膠原生成能力，以及細(xì)胞的增殖和遷移能力。和OPN-FL相比，Thr-OPN具有更強(qiáng)的促進(jìn)HSCs活化、膠原生成、增殖和遷移的能力。
　　第二部分:建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化進(jìn)展模型，證實(shí)Thr-OPN參與肝纖維化的進(jìn)展
　　目的:
　　采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化進(jìn)展模型，研究Thr-OPN在小鼠肝纖維化模型的表達(dá)以及與纖維化發(fā)展之間的關(guān)系，證實(shí)Thr-OPN影響肝纖維化的進(jìn)展

11、。
　　方法:
　　1)建立CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化進(jìn)展模型，首先通過(guò)Masson三色染色評(píng)估了肝纖維化程度;并通過(guò)ELISA方法檢測(cè)肝臟組織中Thr-OPN和OPN-FL的表達(dá);肝纖維化進(jìn)展模型中肝組織HSCs的活化以及膠原合成的相關(guān)指標(biāo)通過(guò)western blot，PCR，和免疫組化檢測(cè)
　　2)通過(guò)western blot，PCR，免疫組化，免疫熒光等方法檢測(cè)肝纖維化患者和小鼠的肝臟組織中整合素受體α4和α9的表

12、達(dá)情況。并利用肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞，檢測(cè)Thr-OPN刺激后肝星狀細(xì)胞中整合素受體α4和α9的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1)在小鼠肝纖維化進(jìn)展中，Thr-OPN表達(dá)水平持續(xù)增高。
　　2)在小鼠肝纖維化進(jìn)展中，Thr-OPN的表達(dá)與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成密切相關(guān)。
　　3)肝硬化患者肝臟組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的高表達(dá)，在小鼠肝纖維化進(jìn)展模型中隨著纖維化程度的加重

13、，肝組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的表達(dá)逐漸增加，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Thr-OPN活化HSCs后同時(shí)能夠誘導(dǎo)HSCs高表達(dá)其自身受體整合素α4和α9。
　　第三部分:利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段，證實(shí)Thr-OPN影響肝纖維化的進(jìn)展
　　目的:
　　通過(guò)OPN基因敲除小鼠誘導(dǎo)肝纖維化模型并給予Thr-OPN切割后暴露的有效肽段，證實(shí)Thr-OPN影響肝纖維化的進(jìn)展
　　方法:
　　

14、體內(nèi)凝血酶原的普遍存在，使體內(nèi)特異性缺失Thr-OPN的狀態(tài)不能夠?qū)崿F(xiàn)。因此為了研究Thr-OPN在纖維化中的作用，我們應(yīng)用OPN基因敲除小鼠，完全去除各種形式的OPN的功能，然后給予小鼠OPN-FL在凝血酶切割后暴露的有效肽段(M5 peptide)，通過(guò)Masson三色染色等方法檢測(cè)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的纖維化程度。
　　結(jié)果:
　　1)在小鼠肝纖維化中， OPN缺乏能夠減輕肝纖維化程度
　　2)凝血酶切割

15、OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能夠加重OPN基因敲除小鼠肝纖維化。
　　結(jié)論:
　　與肝炎患者和健康志愿者相比，Thr-OPN在肝硬化患者中表達(dá)明顯增高，并且Thr-OPN水平與促肝纖維化因子TGF-β水平呈明顯正相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Thr-OPN的表達(dá)與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成緊密相關(guān)。并且其整合素受體α4和α9的肝纖維化進(jìn)展中高表達(dá)。與OPN-FL相比，Thr-OPN能夠有效活化H