凝血酶切割骨橋蛋白在肝纖維化中的作用研究.pdf

1、肝臟纖維化是由于包括膠原蛋白在內(nèi)的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的過度積累所導致的。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分的慢性肝臟疾病。目前，纖維化被認為是機體的一種應答反應，是機體對慢性肝臟疾病導致的肝臟反復損傷的一個損傷-修復反應，同時伴隨修復和再生的過程。
　　肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化被作為ECM沉積的中心事件。在細胞因子刺激之后，靜止的HSCs增殖

2、并轉(zhuǎn)分化為具有促炎和促纖維化功能的纖維母細胞樣細胞。而且，活化的HSCs能夠分泌一系列的細胞因子和生長因子，對于維持HSCs的活化狀態(tài)是有利的。在這些細胞因子中，TGF-β是肝臟中最有效的致纖維化的細胞因子，它可以刺激ECM蛋白的合成。目前大量研究證實HSCs的活化和增值大多是TGFβ依賴途徑的。
　　全長OPN（full length OPN，OPN-FL）是一種可溶性的細胞外基質(zhì)蛋白，也是一種磷酸化糖蛋白。OPN蛋白包含一個經(jīng)

3、典的與細胞表面受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域——精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)構(gòu)域（arginine-glycine-aspartic acid, RGD），這個結(jié)構(gòu)域能夠被細胞表面的整合素受體αvβ3，αvβ5，α4β1，andα8β1識別。這些識別RGD的整合素可表達于多種細胞表面，包括成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞和免疫細胞。OPN-FL在RGD結(jié)構(gòu)域外臨近的氨基酸序列能夠被凝血酶識別并切割。OPN-FL被凝血酶切割之后稱為凝血酶切割的

4、OPN(Thrombin-cleavedOPN，Thr-OPN)，暴露出了一個新的整合素受體結(jié)合的位點--SVVYGLR序列（在小鼠中為SLAYGLR)，這個位點可以被整合素α4β1和α9β1識別。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分類型的慢性肝臟疾病中，包括慢性乙型病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steato

5、hepatitis，NASH)、酒精性肝臟疾病(alcoholic liver disease，ALD)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)。近來的報道指出血漿OPN-FL在肝纖維化患者中升高，其升高的水平可以用于預測肝硬化的進展，并且OPN-FL能夠誘導HSCs的活化。在動物模型中OPN的缺乏可以保護小鼠抵抗肝臟纖維化進展?？傊?，OPN參與了大部分類型慢性肝臟疾病中肝纖維化的過程。但是由于

6、OPN可以以多種形式存在于細胞內(nèi)外，并且能夠與一系列整合素受體結(jié)合發(fā)揮生物學作用，具體是哪一種形式的OPN在肝纖維化中發(fā)揮作用，以及通過哪個受體發(fā)揮作用是不清楚的。這些都是亟待解決的。
　　Thr-OPN暴露一個新的整合素結(jié)合位點——SVVYGLR(小鼠中為SLAYGLR)序列，能夠促進了表達整合素α4和α9的細胞的粘附。近來的研究表明，Thr-OPN參與了酒精誘導小鼠酒精相關(guān)性肝病模型和ConA誘導的小鼠肝炎模型中肝炎的發(fā)病機制

7、。另外，也有研究指出Thr-OPN在心肌纖維化模型中促進了Ⅲ型膠原蛋白的合成。
　　然而，關(guān)于Thr-OPN在人類疾病中的作用研究很少，關(guān)于Thr-OPN在肝硬化中的功能亦知之甚少。因此，本文擬研究Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達情況以及是否明顯參與了肝硬化的進展。
　　第一部分:Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達及其對HSCs的活化和功能影響
　　目的:
　　明確Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達情況，

8、探索Thr-OPN對HSCs的活化和功能影響。
　　方法:
　　1)通過收集健康人，慢乙肝患者以及慢乙肝相關(guān)肝纖維化患者樣本，通過ELISA方法檢測其主要Thr-OPN、OPN-FL和TGF-β在肝纖維化患者中的表達情況。并分別分析Thr-OPN、OPN-FL和血漿中肝纖維化非侵入性指標（透明質(zhì)酸，Ⅲ型前膠原和Ⅳ膠原）以及TGF-β之間的相關(guān)性
　　2)利用肝星狀細胞株LX2細胞，并通過western blot，PCR

9、，ELISA，MTS和微流控系統(tǒng)等方法研究Thr-OPN對HSCs的活化、增殖、遷移和膠原合成功能影響。
　　結(jié)果:
　　1)肝硬化患者血漿Thr-OPN水平明顯高于慢乙肝和健康志愿者。
　　2)肝硬化患者Thr-OPN的表達與血漿中肝纖維化非侵入性指標透明質(zhì)酸，Ⅲ型前膠原和Ⅳ膠原的水平均呈明顯正相關(guān)，也與TGF-β水平呈明顯的正相關(guān)。
　　3)Thr-OPN能夠活化HSCs，并促進其自身分泌TGF-β，有利于H

10、SCs活化狀態(tài)的維持，同時能夠增強HSCs膠原生成能力，以及細胞的增殖和遷移能力。和OPN-FL相比，Thr-OPN具有更強的促進HSCs活化、膠原生成、增殖和遷移的能力。
　　第二部分:建立CCl4誘導的小鼠肝纖維化進展模型，證實Thr-OPN參與肝纖維化的進展
　　目的:
　　采用CCl4誘導肝纖維化進展模型，研究Thr-OPN在小鼠肝纖維化模型的表達以及與纖維化發(fā)展之間的關(guān)系，證實Thr-OPN影響肝纖維化的進展

11、。
　　方法:
　　1)建立CCl4誘導小鼠肝纖維化進展模型，首先通過Masson三色染色評估了肝纖維化程度;并通過ELISA方法檢測肝臟組織中Thr-OPN和OPN-FL的表達;肝纖維化進展模型中肝組織HSCs的活化以及膠原合成的相關(guān)指標通過western blot，PCR，和免疫組化檢測
　　2)通過western blot，PCR，免疫組化，免疫熒光等方法檢測肝纖維化患者和小鼠的肝臟組織中整合素受體α4和α9的表

12、達情況。并利用肝星狀細胞株LX2細胞，檢測Thr-OPN刺激后肝星狀細胞中整合素受體α4和α9的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1)在小鼠肝纖維化進展中，Thr-OPN表達水平持續(xù)增高。
　　2)在小鼠肝纖維化進展中，Thr-OPN的表達與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成密切相關(guān)。
　　3)肝硬化患者肝臟組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的高表達，在小鼠肝纖維化進展模型中隨著纖維化程度的加重

13、，肝組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的表達逐漸增加，體外實驗也證實Thr-OPN活化HSCs后同時能夠誘導HSCs高表達其自身受體整合素α4和α9。
　　第三部分:利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段，證實Thr-OPN影響肝纖維化的進展
　　目的:
　　通過OPN基因敲除小鼠誘導肝纖維化模型并給予Thr-OPN切割后暴露的有效肽段，證實Thr-OPN影響肝纖維化的進展
　　方法:
　　

14、體內(nèi)凝血酶原的普遍存在，使體內(nèi)特異性缺失Thr-OPN的狀態(tài)不能夠?qū)崿F(xiàn)。因此為了研究Thr-OPN在纖維化中的作用，我們應用OPN基因敲除小鼠，完全去除各種形式的OPN的功能，然后給予小鼠OPN-FL在凝血酶切割后暴露的有效肽段(M5 peptide)，通過Masson三色染色等方法檢測CCl4誘導小鼠肝纖維化模型的纖維化程度。
　　結(jié)果:
　　1)在小鼠肝纖維化中， OPN缺乏能夠減輕肝纖維化程度
　　2)凝血酶切割

15、OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能夠加重OPN基因敲除小鼠肝纖維化。
　　結(jié)論:
　　與肝炎患者和健康志愿者相比，Thr-OPN在肝硬化患者中表達明顯增高，并且Thr-OPN水平與促肝纖維化因子TGF-β水平呈明顯正相關(guān)。體內(nèi)實驗證實Thr-OPN的表達與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成緊密相關(guān)。并且其整合素受體α4和α9的肝纖維化進展中高表達。與OPN-FL相比，Thr-OPN能夠有效活化H