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文檔簡介
1、癌癥嚴重危害人類健康,攻克癌癥一直受到醫(yī)療界的關注;因此多種治療藥物及其方法孕育而生,其中基因治療成為21世紀研究熱點?;蛑委熓峭ㄟ^插入治療基因至病變細胞內而產生特定功能的蛋白質或抑制異?;虮磉_,從而治療疾病的一種新手段。安全、高效的基因轉染系統(tǒng)的研發(fā)成為關鍵。其癌細胞靶向性的研究又成為關鍵中的關鍵。目前基因載體分為兩類:病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因具有制備簡單、低免疫原性且攜帶大分子量DNA及生物安全性高等優(yōu)點而倍受青睞。<
2、br> 在非病毒載體的制備過程中,陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI,Polyethyenimine)因其有較高的轉染率而被看作非病毒載體的黃金標準。PEI有線型或分枝狀結構,有較高的陽性電荷,與帶有陰性電荷的DNA或RNA結合能力較強,所形成的復合物可通過靜置吸附等作用進入細胞。PEI通過著名的質子海綿效應,使溶酶體破裂從而將內吞的DNA釋放到細胞質或者細胞核中并表達。PEI的分子量的范圍很廣,5000—25000 Da是目前作為基
3、因轉染載體常用的一個范圍。一般說PEI的基因轉染效率隨著其分子量的增高而增大,但其毒性也隨之增大。如分枝狀PEI-25 KDa的轉染效率和毒性遠比10 KDa的大,反之亦然。同時有報道PEI作為基因轉染載體直接體內應用會導致紅細胞的聚集,并與血液中的白蛋白等非特異性結合,影響轉染效率。
為了降低PEI毒性,提高其轉染率,通常的方法是改性PEI。改性后的PEI能提高PEI和DNA復合物的穩(wěn)定性。通常聚乙二醇、環(huán)糊精和殼聚糖等
4、高分子生物降解材料運用到PEI的結構修飾中,形成一種新的結構。比如共聚物和聚輪烷等,并通過鏈接配體,利用某配體與癌細胞表面高表達某受體的專屬性特異結合的特點來提高靶向性,提高治療的作用。
目的:本研究選用三種不同分子量的PEI(0.6 KDa,10 KDa和25 KDa,均為支鏈)接枝到以葉酸為封端劑而制備成的多聚輪烷(PR)上,形成具有葉酸受體靶向的聚乙烯亞胺-聚輪烷超分子衍生物(FPP),探討不同分子量PEI接枝后FP
5、P性能和毒性的變化規(guī)律,并且研究FPP的DNA壓縮性、緩沖性、抗核酸酶降解性以及轉染性。從體內外評價FPP的傳遞性能,為臨床提供安全高效的給藥系統(tǒng)。
研究方法和內容:分三大部分
第一部分、以葉酸為封端劑的聚輪烷-聚乙酰亞胺超分子衍生物的合成、表征和性能測試
1.聚合物的合成:a、準聚輪烷(pseudo—PR)的制備;b、葉酸活性酯(FA—NHS)的制備;c、多聚輪烷(PR)的制備;d、FPP的制
6、備。
2.聚合物表征:先后使用NMR、IR和UV等對聚合物進行表征:通過1H-NMR中FPP不同組分的積分高比,求出a-環(huán)糊精(a-CD)上PEI的接枝率,FPP的平均分子量(Mw)。
3.采用酸堿滴定法結合公式B=dC(HCl)/dpH計算聚合物的緩沖容量。
4.瓊脂糖凝膠電泳法考察不同分子量FPP,BPP和PEI-25 KDa與DNA的結合能力,及其對DNh在核酸酶I作用下的保護作用,掃描電
7、鏡觀察復合物的形態(tài)。
5.復合物的毒性研究:
a、不同濃度的FPPs(0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP、PEI-25 KDa載體與DNA形成的復合物對Hela細胞和16 HBE細胞的影響;
b、FPPs(0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP(BOC—Tyr—Osu為封端劑的聚輪烷-聚乙烯亞胺)、PEI-25KDa載體與pLuc在不同N/P比的情況下形成的復合物
8、對Hela細胞和16 HBE細胞的影響。
第二部分、FPP物理、生物性能的研究
1.采用堿裂解法,通過制備大腸桿菌感受態(tài)細胞、pAAV—EGFP和pLuc分別轉入和重組增殖、堿裂解法純化質粒等工序,提取質粒DNA;經瓊脂糖凝膠鑒定大小及純度。
2.采用激光粒度儀測定不同分子量FPP,BPP和PEI-25 Kna分別與DNA所形成的復合物的粒徑、Zeta電位。
第三部分、體內外復合物
9、生物性能的研究
1.體外轉染率的研究
a、Luciferace評估FPPs(0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP、PEI-25 KDa載體與pLuc在不同N/P比的情況下形成的復合物對KB細胞的轉染影響;
b、Luciferece評估FPP(0.6 KDa)、BPP、PEI-25 KDa與pLuc(N/P=20)形成的復合物在無血清、有1%胎牛血清(FBS)和0.1%蛋白質的條件
10、下對KB細胞的轉染影響;
c、流式細胞儀評估FPP(0.6 KDa)、BPP、PEI-25 KDa與pAAV—EGFP(N/P=20)形成的復合物對KB細胞和A549細胞的轉染影響;
d、流式細胞儀評估FPPs(0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP、PEI-25 KDa載體與pAAV-EGFP(N/P=20)形成的復合物分別對HEK293T、KB、LoVo、A549細胞轉染影響。
11、 2.體內轉染率的研究:
a、動物模型的制備;
b、通過瘤內注射復合物的方式,分別在24小時和48小時,luciferace檢測PBS控制組,裸DNA(pLuc)組,PEI-25 KDa/pLuc,BPP/pLuc,FPP(0.6KDa)/pLuc,Lipotanmine/pLuc組的轉染率;
c、尾靜脈注射,通過Caspase-9和Bax蛋白表達及瘤重大小的比較來檢測聚合物/p53復合物的抗瘤
12、作用;
d、通過裸DNA(p53),PEI/DNA(p53),BPP/DNA(p53)和FPP(0.6KDa)/DNA(p53)組小鼠肝臟、脾臟的HE染色病理片的比較,觀察載體在體內毒性的大小。
結果:
第一部分、以葉酸為封端劑的聚輪烷-聚乙酰亞胺超分子衍生物的合成、表征
1.NMR測定:a、pseudo-PR固體核磁顯示:pseudo—PR中a-CD上的C1、C4的單峰消失,取而
13、代之的是寬峰的出現。b、PR1H-NMR的顯示:在6.6ppm、7.5ppm和8.5ppm處出現FA質子峰;同時,在3-4ppm之間出現a-CD上C2、c4、C3、C5、C6相連的寬峰;3.6ppm的PEG上的CH2峰,結果表明FA封端成功。c、FPP1H-NMR的顯示:在6.7ppm、7.7ppm和8.7ppm處出現FA質子峰;同時,在3-4ppm之間出現a-CD上C2、C4、C3、C5、C6相連的寬峰;3.6ppm的PEG上的CH2
14、峰,另外,在2-3ppm之間出現PEI中-(CH2-CH2-NH)-峰,表明FPP制備成功。2、IR的測定:PR在1650 cm-1顯示有酰胺鍵形成,1605cm-1處顯示有苯環(huán)結構,701.4 cm-1(苯環(huán)上的C-H),苯環(huán)特征的出現,意味著葉酸的鏈接成功。FPP:由于PEI氨基與a-CD中O6H反應形成酯鍵,因此在1705 cm-1,1031.42cm-1,有一個較強的吸收。3、UV的測定:與FA相比,FPP上FA的紫外吸收由原來
15、的250nm、280nm紅移到255nm和289nm。
接枝率的測定:FPP上0.6 KDa,10 KDa和25 KDa的接枝率分別為86.67%,36.66%和15.33%。
FPP(0.6K),FPP(10K)。FPP(25K)平均分子量(Mn):85920 Da,453520Da,473520DaFPPs上各組分比值PEG:a-CD:PEI(0.6K,10K,25K)=1:20:(102,43.9,18
16、.40)。
2.不同分子量的FPP,緩沖容量隨著分子量的增加而增大。
3.凝膠阻滯實驗顯示,FPP(0.6 KDa,10 KDa和25 KDa)在N/P比2-4之間,有較好的阻滯作用,其結果稍差與PEI-25 KDa。
4.聚合物對Hela、16 HBE細胞的相對生長率影響的研究結果發(fā)現:與PEI-25K相比,FPP(0.6KDa,10KDa和25KDa)毒性顯著性降低,FPP(0.6KDa,1
17、0KDa和25KDa)、BPP的IC50(half maximal(50%)inhibitory concentration(IC)of a substance)值分別為:(Hela:189ug/ml,178 ug/ml,160 ug/ml,196 ug/ml;16 HBE:193ug/ml,182 ug/ml,171 ug/ml,192 ug/ml。
第二部分、FPP物理、生物性能的研究
1.采用堿裂解法制
18、備及純化后的pAAV-EGFP和pLuc純度和大小合適,A260/A280(pAAV-EGFP)=1.90±0.055;A260/A280(PLuc)=1.84±0.021;質粒分子量為5.3kb pAAV—EGFP和4.7kb的pLuc;pAAV—EGFP和pLuc質粒的濃度計算分別為278.83±1.11ug/ml和269.86±1.03ug/ml。
2.當N/P比到達10時,不同分子量的FPP與DNA結合成復合物的粒
19、徑小于140nm;當N/P比升高到20時,zeta電位在20-30 Mv之間。
第三部分、體內外復合物生物性能的研究
1.體外轉染效率:首先確定N/P。當N/P=20時,FPP(0.6KDa,10KDa和25KDa),的轉染效率大于BPP和PEI-25K的幅度比它們在其他N/P比時的增長幅度更大。而后考察了其他轉染條件。最后得出復合物最佳的轉染條件:轉染效率每孔加入DNA2ug;與DNA形成復合物的時間為30
20、min;復合物在細胞上作用的時間為4h;在有血清的條件下,轉染效率有顯著的升高(*p<0.05和*<0.05),FPP(0.6K)/DNA轉染效率分別是無血清的8.5倍和10倍;和Opti—MEM(blank)相比,10%-15%FBS和ALB(0.1—0.2%)轉染效率分別擴大了2.5—3.5倍;在不同濃度FBS和ALD中的轉染率無明顯差異。
2.體內轉染效率:
a、成功構建小鼠腫瘤模型。
b
21、、Liuciferase評估結果顯示在24h FPP(0.6K)(N/P=20)的轉染率與PEI-25KDa(N/P=10)and BPP組相比分別高出6.1和5.6倍(*p<0.05 and*p<0.05),并且?guī)缀跏?36倍的裸DNA組的熒光量。
C、體內抗瘤活性的評估:(a)、腫瘤重量:與BPP/p53、PEI-25 KDa/p53、naked p53、PBS groups相比,FPP(0.6K)/p53組瘤重明顯變
22、小(*p<0.05,*p<0.05,**p<0.05,**p<0.05,respectively);(b)、caspase-9和bax表達:和正常對照組、PEI-25 KDa/p53(N/P=10),BPP/p53組和FPP(0.6K)(N/P=20)/p53組相比,KB模型組中的caspase-9 and bax表達顯著降低(*p<0.05,*p<0.05,*p<0.05,and,*p<0.05),其中FPP/p53組顯著性低于BPP
23、/p53組(*p<0.05,*p<0.05)。
d、HE染色:FPP(0.6K),FPP(10K)、FPP(25K)和裸DNA四組之間的小鼠肝臟和脾臟未見有什么變化,表明FPP(0.6K),FPP(10K)、FPP(25K)載體毒性較小。
結論:
1.成功構建新的非病毒載體(聚乙酰亞胺-聚輪烷,FPP)超分子聚合物;通過一系列的工藝研究得出了最佳的摩爾投料比,并且此工藝可控。
2.
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