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文檔簡介
1、近年來,基因治療在遺傳病、腫瘤治療等方面有很好的前景,引起廣泛關(guān)注?;蛑委熋媾R的瓶頸問題是尋找一種高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染載體,將基因藥物遞送至特定的細胞中,并能穩(wěn)定地維持其功能。目前,基因載體一般分為非病毒載體和病毒載體,而陽離子脂質(zhì)體是非病毒載體中最具潛力的基因載體之一。
本論文主要考察陽離子膽固醇衍生物的鏈接基團和鏈長對轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染效率的影響,分別以N,N-二甲基乙二胺(DMAEA)或N,N-二甲基丙二胺(DMAPA)和膽
2、固醇甲酰氯反應(yīng)生成鏈接基團為酯基的(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)及多一個碳的同系物(N,N-二甲基氨基丙基)-氨基甲?;鵠膽固醇(DMAPA-Chol);和CHEMS-NHS反應(yīng)生成鏈接基團為琥珀酸基的N-(N’,N’-二甲基)乙基丁二酸單膽固醇酯單酰胺(DC-CHEMS)和多一個碳的N-(N’,N’-二甲基)丙基丁二酸單膽固醇酯單酰胺(DMAPA-CHEMS)。合成并純化的產(chǎn)物經(jīng)TLC、質(zhì)譜和1H-H
3、MR譜分析,確證為目標(biāo)產(chǎn)物。
用薄膜分散法以陽離子膽固醇衍生物和大豆磷脂S100為膜材制備脂質(zhì)體,同時對其進行理化性質(zhì)和細胞毒性以及細胞內(nèi)攝取、轉(zhuǎn)染等的評價。DC-Chol、DMAPA-Chol、DC-CHEMS、DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體的數(shù)均粒徑分別為115.8±9.3nm、118.0±15.3nm、120.0±14.2nm、124.1±12.8nm,表面電位分別為16.94±1.56mv、17.40±0.76mv、23
4、.63±2.52mv、26.76±3.60mv。四種脂質(zhì)體形態(tài)規(guī)整,幾乎都呈圓形。當(dāng)+/-電荷比在4:1以上時,四種脂質(zhì)體均能將pDNA阻滯在上樣孔處,并都有較強的保護pDNA的能力。四種脂質(zhì)體的溶血率都在2%以下。MTT結(jié)果顯示,當(dāng)磷脂濃度在0.05mg/ml以下時,四種脂質(zhì)體的細胞存活率都在80%以上,細胞毒性低。+/-電荷比在一定范圍內(nèi),脂質(zhì)體/F-ODN的細胞內(nèi)熒光強度隨著脂質(zhì)體用量的增加而增加,而且在最低+/-=1:1時的攝取
5、效果大于市售試劑Lipofectamine?2000。轉(zhuǎn)染實驗測定結(jié)果顯示,四種脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效果低下,明顯低于市售試劑Lipofectamine?2000。
普通的陽離子膽固醇脂質(zhì)體中引入R8后,與pDNA的結(jié)合能力增加;細胞毒性相對增加,但增加的幅度不大,DC-CHEMS組的毒性幾乎不變,存活率達100%,變化較大的是DC-Chol組,磷脂濃度在0.01mg/ml以下時,細胞的存活率約為80%;脂質(zhì)體與R8孵育后能促進復(fù)合物
6、入胞,DMAPA-Chol脂質(zhì)體組促進效果最明顯,平均熒光強度提高2.14倍,DC-Chol、DC-CHEMS、DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體組分別為1.50倍、1.21倍、1.43倍;但細胞的轉(zhuǎn)染能力并沒有達到預(yù)期的結(jié)果,在原來的基礎(chǔ)上沒有任何改善,只有少量的pDNA表達,與Lipofectamine?2000的轉(zhuǎn)染效果相差很大。雖然加入R8后的復(fù)合物更能促進入胞,但目的基因在胞內(nèi)的命運并沒有改變,轉(zhuǎn)染效率依然低下。
以陽離子
7、膽固醇衍生物和DOPE為膜材制備脂質(zhì)體,同時對其進行理化性質(zhì)和細胞水平的評價。DC-Chol、DMAPA-Chol、DC-CHEMS、DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體的數(shù)均粒徑分別為173.3±6.4nm、179.9±8.1nm、147.6±5.9nm、149.1±5.1nm,表面電位分別為24.46±4.50mv、25.33±5.19mv、27.38±4.22mv、29.21±3.69mv;四種脂質(zhì)體在+/-為8:1-1:8范圍內(nèi),轉(zhuǎn)染效
8、果有個最強值,效果明顯優(yōu)于Lipofectamine?2000;在同一+/-時,發(fā)現(xiàn)加入R8的脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率反而沒有不加R8的好,原因可用胞內(nèi)分布的結(jié)果初步分析,DOPE脂質(zhì)體介導(dǎo)的F-ODN主要位于細胞核,加入R8后主要位于細胞核周圍,而S100脂質(zhì)體介導(dǎo)的F-ODN在細胞核中含量最少。Western blot結(jié)果顯示,DC-CHEMS和DMAPA-CHEMS組的蛋白條帶比DC-Chol和DMAPA-Chol的淺,說明DC-CHEM
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