百里醌通過上皮--間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Twist1和Zeb1抑制宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：宮頸癌是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，由于受到非特異性細(xì)胞毒性和耐藥性影響，化療應(yīng)用受到限制。天然產(chǎn)物百里醌(Thymoquinone，TQ)，在不同的癌癥中，可作用于不同的信號傳導(dǎo)途徑，被認(rèn)為是一種很有前途的抗癌分子。抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)是一種重要的抗癌研究方向。在本研究中，百里醌被用于治療宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa，從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制侵

2、襲轉(zhuǎn)移方面研究抗腫瘤藥物百里醌對宮頸癌細(xì)胞的效應(yīng)，觀察不同濃度下百里醌對宮頸癌細(xì)胞生長的影響，研究對EMT調(diào)控蛋白和癌癥轉(zhuǎn)移的影響。研究百里醌用于治療宮頸癌的機(jī)制和可能性，為宮頸癌的臨床治療提供新靶標(biāo)、新思路。
　　方法：①對宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa，用不同劑量(終濃度0μM/mL、1μM/mL、5μM/mL、10μM/mL、20μM/mL、40μM/mL)的百里醌，作用不同時間（12h、36h、24h和48h）后，應(yīng)用C

3、CK-8法檢測百里醌對細(xì)胞的毒性作用。②用實(shí)時細(xì)胞分析儀檢測百里醌不同劑量（終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL）作用下，對宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的生長、侵襲、遷移的影響。③流式細(xì)胞儀檢測百里醌不同劑量（終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL）作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后，對細(xì)胞凋亡率的影響。④實(shí)時熒光定量PCR檢測百里醌不同劑量（終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL）作用宮頸癌細(xì)胞

4、系CaSki和SiHa后，EMT分子以及凋亡相關(guān)不同基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。⑤Western Blot檢測百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后，不同EMT分子以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。⑥百里醌不同劑量（終濃度0μM/mL、1μM/mL、2μM/mL、4μM/mL、8μM/mL、16μM/mL）作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后，用熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測TQ是否作用

5、于Twist1和Zeb1基因的啟動子。⑦百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL)作用于宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后，檢測TQ對Twist1的啟動子是否有甲基化作用。
　　結(jié)果：①通過CCK-8檢測，結(jié)果顯示TQ劑量在5μM/mL或者較大劑量，作用時間在24h或者更長，對宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa有明顯的細(xì)胞毒性作用，并呈劑量依賴性。②通過實(shí)時細(xì)胞功能分析儀檢測，百里醌在5μM/mL或更大的劑量下可抑制宮頸癌細(xì)

6、胞系CaSki和SiHa的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。③流式細(xì)胞儀結(jié)果表明TQ可以增加宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的細(xì)胞凋亡率。④實(shí)時熒光定量PCR檢測，TQ不同劑量(終濃度5μM/mL和10μM/mL)作用24h后，宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中Twist1，Zeb1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，并且E-Cadherin的表達(dá)升高。在CaSki細(xì)胞系中，還影響了Vimentin和MMP-9，在SiHa細(xì)胞系還影響了Slug。Bax和Bcl

7、-2在宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中都沒有明顯變化。⑤Western blot結(jié)果顯示，TQ不同劑量(終濃度5μM/mL和10μM/mL)作用36h后，宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中Twist1，Zeb1的蛋白水平降低，而E-Cadherin的表達(dá)水平升高。但宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中凋亡相關(guān)蛋白PARP,Caspase-3，Caspase-9的蛋白水平幾乎沒有變化。⑥熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)分析表明百里醌分別減少了Twis

8、t1和Zeb1的啟動子活性，并且RLU的減少與TQ劑量的增加存在依賴性，證明Twist1和Zeb1可能是百里醌的直接作用靶點(diǎn)。⑦通過百里醌處理(終濃度5μM/mL，24h)后的宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa，Twist1基因近端啟動子進(jìn)行甲基化后焦磷酸測序，數(shù)據(jù)分析有輕微增加。
　　結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明，百里醌除了明顯抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖，還抑制了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。百里醌靶向作用于EMT-TFs，如Twist1和Zeb1