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文檔簡介
1、目的:
研究ZEB1對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及ESRP1表達(dá)的調(diào)控機制。
方法:
1.用TGF-β誘導(dǎo)常規(guī)培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞,通過WesternBlotting試驗,檢測相關(guān)標(biāo)志物如ZEB1、ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化。用慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-NC-siRNA感染A549細(xì)胞,分四組:LV-ZEB1-siRNA組、LV-NC-
2、siRNA組和用TGF-β刺激48h后再感染LV-ZEB1-siRNA組、LV-NC-siRNA組,WesternBlotting試驗檢測ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化;劃痕試驗和侵襲試驗檢測ZEB1沉默對細(xì)胞運動能力的影響。
2.構(gòu)建ZEB1真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,WesternBlotting試驗檢測空白對照組(未轉(zhuǎn)染)、實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc
3、-His-ZEB1)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1/myc-His)中ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化;劃痕試驗和侵襲試驗檢測ZEB1高表達(dá)對細(xì)胞運動能力的影響。為進(jìn)一步研究ZEB1對ESRP1的調(diào)節(jié),構(gòu)建ESRP1熒光素酶報告基因載體pGL4.17-ESRP1,將重組質(zhì)粒pGL4.17-ESRP1和pcDNA3.1/myc-His-ZEB1及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,48
4、h后測定實驗組(重組質(zhì)粒pGL4.17-ESRP1和pcDNA3.1/myc-His-ZEB1及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染)、陰性對照組(重組質(zhì)粒pGL4.17-ESRP1和空質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染)和陽性對照組(共轉(zhuǎn)染6h換液后加入TGF-β刺激)的熒光素酶活性。
結(jié)果:
1.(1)經(jīng)TGF-β(5ng/ml)刺激后,A549細(xì)胞發(fā)生EMT,E-cadherin和ESRP1表達(dá)減少;N-c
5、adherin、fibronectin和ZEB1表達(dá)增加。感染ZEB1-siRNA與感染NC-siRNA的細(xì)胞相比,ZEB1蛋白的表達(dá)受到明顯抑制;而且感染ZEB1-siRNA的細(xì)胞,TGF-β刺激導(dǎo)致的上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESRP1的表達(dá)減少被逆轉(zhuǎn);而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)增加未受明顯影響。
(2)劃痕試驗:與陰性對照組相比,TGF-β組劃痕大部分愈合(P<0.05);T
6、GF-β刺激后,ZEB1沉默組較陰性對照組遷移速度明顯偏慢(P<0.05)。
(3)侵襲試驗:與陰性對照組相比,TGF-β刺激后穿膜細(xì)胞明顯增多(P<0.05);TGF-β刺激后,ZEB1沉默組穿膜細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。
2.(1)空白對照組、陰性對照組蛋白表達(dá)無明顯差異;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組相比,ZEB1蛋白的表達(dá)明顯增多,且上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESR
7、P1的表達(dá)減少,而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)未受明顯影響。
(2)劃痕試驗:陰性對照組與空白對照組比較沒有顯著差異(P>0.05);pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組比較,遷移速度較快(P<0.05)。
(3)侵襲試驗:陰性對照組與空白對照組比較沒有顯著差異(P>0.05);pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組比較,穿膜細(xì)胞明顯增多(P<0.
8、05)。
(4)熒光素酶試驗:陰性對照組ESRP1啟動子相對熒光素酶活性為0.49±0.038μm,實驗組為0.32±0.063μm,陽性對照組為0.21±0.030μm,說明ZEB1可抑制ESRP1的啟動子活性。
結(jié)論:
1.TGF-β可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT。
2.ZEB1表達(dá)下調(diào),可使TGF-β刺激導(dǎo)致的上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESRP1的表達(dá)減少被逆轉(zhuǎn);間質(zhì)標(biāo)志
9、物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)增加未受明顯影響。ZEB1表達(dá)增多,可使上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESRP1的表達(dá)減少,而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)未受明顯影響。ZEB1可部分抑制EMT過程。
3.ZEB1表達(dá)下調(diào)可降低A549細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力,ZEB1高表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力,ZEB1可能在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用。
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