ZEB1對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及ESRP1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 研究ZEB1對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及ESRP1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.用TGF-β誘導(dǎo)常規(guī)培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞，通過WesternBlotting試驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物如ZEB1、ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化。用慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-NC-siRNA感染A549細(xì)胞，分四組:LV-ZEB1-siRNA組、LV-NC-

2、siRNA組和用TGF-β刺激48h后再感染LV-ZEB1-siRNA組、LV-NC-siRNA組，WesternBlotting試驗(yàn)檢測(cè)ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化;劃痕試驗(yàn)和侵襲試驗(yàn)檢測(cè)ZEB1沉默對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。
　　 2.構(gòu)建ZEB1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，WesternBlotting試驗(yàn)檢測(cè)空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）、實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc

3、-His-ZEB1）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1/myc-His）中ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化;劃痕試驗(yàn)和侵襲試驗(yàn)檢測(cè)ZEB1高表達(dá)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。為進(jìn)一步研究ZEB1對(duì)ESRP1的調(diào)節(jié)，構(gòu)建ESRP1熒光素酶報(bào)告基因載體pGL4.17-ESRP1，將重組質(zhì)粒pGL4.17-ESRP1和pcDNA3.1/myc-His-ZEB1及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，48

4、h后測(cè)定實(shí)驗(yàn)組（重組質(zhì)粒pGL4.17-ESRP1和pcDNA3.1/myc-His-ZEB1及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染）、陰性對(duì)照組（重組質(zhì)粒pGL4.17-ESRP1和空質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染）和陽(yáng)性對(duì)照組（共轉(zhuǎn)染6h換液后加入TGF-β刺激）的熒光素酶活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.(1)經(jīng)TGF-β（5ng/ml）刺激后，A549細(xì)胞發(fā)生EMT，E-cadherin和ESRP1表達(dá)減少;N-c

5、adherin、fibronectin和ZEB1表達(dá)增加。感染ZEB1-siRNA與感染NC-siRNA的細(xì)胞相比，ZEB1蛋白的表達(dá)受到明顯抑制;而且感染ZEB1-siRNA的細(xì)胞，TGF-β刺激導(dǎo)致的上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESRP1的表達(dá)減少被逆轉(zhuǎn);而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)增加未受明顯影響。
　　 (2)劃痕試驗(yàn):與陰性對(duì)照組相比，TGF-β組劃痕大部分愈合(P＜0.05);T

6、GF-β刺激后，ZEB1沉默組較陰性對(duì)照組遷移速度明顯偏慢(P＜0.05)。
　　 (3)侵襲試驗(yàn):與陰性對(duì)照組相比，TGF-β刺激后穿膜細(xì)胞明顯增多(P＜0.05);TGF-β刺激后，ZEB1沉默組穿膜細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。
　　 2.(1)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組相比，ZEB1蛋白的表達(dá)明顯增多，且上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESR

7、P1的表達(dá)減少，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)未受明顯影響。
　　 (2)劃痕試驗(yàn):陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較沒有顯著差異（P＞0.05）;pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組比較，遷移速度較快(P＜0.05)。
　　 (3)侵襲試驗(yàn):陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較沒有顯著差異(P＞0.05);pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組比較，穿膜細(xì)胞明顯增多(P＜0.

8、05)。
　　 (4)熒光素酶試驗(yàn):陰性對(duì)照組ESRP1啟動(dòng)子相對(duì)熒光素酶活性為0.49±0.038μm，實(shí)驗(yàn)組為0.32±0.063μm，陽(yáng)性對(duì)照組為0.21±0.030μm，說明ZEB1可抑制ESRP1的啟動(dòng)子活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.TGF-β可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　 2.ZEB1表達(dá)下調(diào)，可使TGF-β刺激導(dǎo)致的上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESRP1的表達(dá)減少被逆轉(zhuǎn);間質(zhì)標(biāo)志

9、物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)增加未受明顯影響。ZEB1表達(dá)增多，可使上皮標(biāo)志物E-cadherin和ESRP1的表達(dá)減少，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和fibronectin的表達(dá)未受明顯影響。ZEB1可部分抑制EMT過程。
　　 3.ZEB1表達(dá)下調(diào)可降低A549細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，ZEB1高表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，ZEB1可能在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用。