先鋒轉(zhuǎn)錄因子FoxA1沉默誘導(dǎo)大腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、研究背景:
　　大腸癌是我國常見的發(fā)病率呈明顯上升趨勢的惡性腫瘤之一，居腫瘤死因的第4位，目前的五年生存率徘徊在50-60％左右，浸潤轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是治療失敗的原因。迄今對大腸癌浸潤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機制尚待深入，闡明大腸癌浸潤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機制是開展有效治療的基礎(chǔ)，對提高大腸癌患者的生存期限和生活質(zhì)量有重要意義。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是指在特定的生理和病理

2、情況下，具有極性的上皮細胞向具有移行能力的間充質(zhì)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。在EMT過程中，上皮細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，最終成為成纖維細胞樣的間質(zhì)細胞表型，導(dǎo)致細胞極性消失、細胞間連接松散，同時細胞表型標(biāo)志物發(fā)生改變，上皮表型如角蛋白絲、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)喪失，而獲得波形蛋白(Vimemin)、纖維連接蛋白、N-鈣粘蛋白等間質(zhì)表型的表達。其中E-cadherin水平的下降可以導(dǎo)致細胞的粘附力降低，使細胞獲得易于侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，E-

3、cadherin表達的丟失已經(jīng)被認(rèn)為是EMT最顯著的特征。近來EMT與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究成為了研究熱點。依據(jù)EMT的特定生生物學(xué)環(huán)境、功能的不同及其對機體的不同影響將其大致分為3種類型:Ⅰ型EMT與胚胎發(fā)生、器官發(fā)育相關(guān)，Ⅱ型EMT與創(chuàng)傷愈合、組織再生和器官纖維化相關(guān)，Ⅲ型EMT與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，這型EMT發(fā)生于部分惡性腫瘤細胞中，腫瘤上皮細胞通過EMT獲得了很強侵襲和轉(zhuǎn)移能力，隨血流轉(zhuǎn)移至不同部位，進一步通過間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(m

4、esenchyal epithelial transition， MET)過程形成上皮細胞的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，目前在上皮來源的腫瘤中，如卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、鼻咽癌、大腸癌等都可以監(jiān)測到EMT過程，EMT在腫瘤的演進和轉(zhuǎn)移中的作用是瞬時和可逆的，EMT過程受到了Snail，Slug，NF-KB，Twist等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
　　1先鋒轉(zhuǎn)錄因子FoxA1是一個轉(zhuǎn)錄因子FoxA家族中的一員，它通過和靶基因染色體序列的啟動子或者

5、增強子結(jié)合，誘導(dǎo)核小體結(jié)構(gòu)重排使后續(xù)的轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合在染色質(zhì)上從而促進靶基因的轉(zhuǎn)錄。FoxA1在生命體早期發(fā)育器官形成、成體的代謝和穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤的發(fā)展方面都具有重要作用。在乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)FoxA1與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)并且能夠調(diào)控腫瘤上皮細胞和間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化，其在大腸癌浸潤發(fā)展中的作用迄今尚未見報道。
　　實驗?zāi)康?
　　擬在先前研究的基礎(chǔ)上，研究FoxA1在大腸癌組織中的表達情況，并通過基因表達

6、譜芯片技術(shù)分析大腸癌細胞中FoxA1沉默后基因表達譜的變化，為研究FoxA1在大腸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制和尋找新的生物學(xué)標(biāo)記及靶向治療藥物提供基礎(chǔ)。
　　實驗方法:
　　1.免疫組化二步法分析31例大腸癌臨床樣本中FoxA1的表達分布。
　　2.通過將大腸癌細胞系SW620感染重組慢病毒的方法敲除FoxA1，并用有限稀釋克隆法建立穩(wěn)定沉默細胞系;通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在293T細胞中過表達FoxA1。
　　3.用Wes

7、tern Blot的方法分別對比FoxA1沉默SW620細胞和正常表達的SW620細胞中EMT相關(guān)基因的表達和FoxA1過表達的293T細胞和正常293T細胞EMT相關(guān)基因的表達。
　　4.提取FoxA1沉默的SW620細胞和正常表達的SW620細胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成eDNA后做基因表達譜芯片分析。
　　5.基因芯片的結(jié)果用DAVID軟件和atBIONET軟件進行GO分析、pathway分析和網(wǎng)絡(luò)分析。
　　實驗結(jié)果:

8、
　　1.FoxA1在31例大腸癌組織樣本中都呈強陽性表達，其表達主要位于大腸癌上皮細胞內(nèi)，間質(zhì)細胞不表達FoxA1。其中部分大腸癌上皮細胞內(nèi)FoxA1表達降低或缺失，可能與發(fā)生EMT有關(guān)。
　　2.用Western blot的方法發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞SW620細胞中FoxA1沉默后上皮表型標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達下調(diào)，間質(zhì)表型標(biāo)志波形蛋白(Vimentin)表達上調(diào);293T細胞中過表達FoxA1后，EMT

9、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Slug和Snail表達水平均下降，提示FoxA1沉默可以誘導(dǎo)EMT發(fā)生。
　　3.經(jīng)Human Genome U133 Plus2.0 Array基因表達譜芯片分析，F(xiàn)oxA1沉默組和對照組之間有1469個差異表達基因，其中666個基因FoxA1沉默后表達上調(diào)，803個基因表達下調(diào)。其中間質(zhì)同源框蛋白2基因(MEOX2)相對上升了67.76倍，神經(jīng)源性絲氨酸蛋白酶抑制劑基因（SERPINI1）上升了33.05倍，核糖

10、體蛋白S6基因（RPS6）下降了98.04倍，細胞因子樣蛋白1基因(CYTL1)下降了77.13倍，白細胞活化粘附分子基因(ALCAM)下降了57.10倍。
　　4.GO分析提示差異表達的基因的功能分類主要集中在細胞粘附、發(fā)育和結(jié)合等方面;Pathway分析顯示差異基因參與的信號通路主要有腫瘤相關(guān)信號通路，黏著斑信號通路，胰島素信號通路等;網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測了差異表達基因中的潛在的分子標(biāo)志物。
　　結(jié)論:
　　1.部分大腸癌