先鋒轉錄因子FoxA1沉默誘導大腸癌細胞上皮間質轉化研究.pdf

1、研究背景:
　　大腸癌是我國常見的發(fā)病率呈明顯上升趨勢的惡性腫瘤之一，居腫瘤死因的第4位，目前的五年生存率徘徊在50-60％左右，浸潤轉移等惡性生物學行為是治療失敗的原因。迄今對大腸癌浸潤轉移和復發(fā)機制尚待深入，闡明大腸癌浸潤轉移和復發(fā)機制是開展有效治療的基礎，對提高大腸癌患者的生存期限和生活質量有重要意義。
　　上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是指在特定的生理和病理

2、情況下，具有極性的上皮細胞向具有移行能力的間充質細胞發(fā)生轉化的現(xiàn)象。在EMT過程中，上皮細胞發(fā)生表型轉化，最終成為成纖維細胞樣的間質細胞表型，導致細胞極性消失、細胞間連接松散，同時細胞表型標志物發(fā)生改變，上皮表型如角蛋白絲、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)喪失，而獲得波形蛋白(Vimemin)、纖維連接蛋白、N-鈣粘蛋白等間質表型的表達。其中E-cadherin水平的下降可以導致細胞的粘附力降低，使細胞獲得易于侵襲和轉移的特性，E-

3、cadherin表達的丟失已經(jīng)被認為是EMT最顯著的特征。近來EMT與腫瘤侵襲與轉移相關的研究成為了研究熱點。依據(jù)EMT的特定生生物學環(huán)境、功能的不同及其對機體的不同影響將其大致分為3種類型:Ⅰ型EMT與胚胎發(fā)生、器官發(fā)育相關，Ⅱ型EMT與創(chuàng)傷愈合、組織再生和器官纖維化相關，Ⅲ型EMT與腫瘤侵襲和轉移相關，這型EMT發(fā)生于部分惡性腫瘤細胞中，腫瘤上皮細胞通過EMT獲得了很強侵襲和轉移能力，隨血流轉移至不同部位，進一步通過間質上皮轉化(m

4、esenchyal epithelial transition， MET)過程形成上皮細胞的腫瘤轉移灶，目前在上皮來源的腫瘤中，如卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、鼻咽癌、大腸癌等都可以監(jiān)測到EMT過程，EMT在腫瘤的演進和轉移中的作用是瞬時和可逆的，EMT過程受到了Snail，Slug，NF-KB，Twist等多種轉錄因子的調控。
　　1先鋒轉錄因子FoxA1是一個轉錄因子FoxA家族中的一員，它通過和靶基因染色體序列的啟動子或者

5、增強子結合，誘導核小體結構重排使后續(xù)的轉錄因子能結合在染色質上從而促進靶基因的轉錄。FoxA1在生命體早期發(fā)育器官形成、成體的代謝和穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤的發(fā)展方面都具有重要作用。在乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)FoxA1與腫瘤的侵襲和轉移呈負相關并且能夠調控腫瘤上皮細胞和間質細胞的轉化，其在大腸癌浸潤發(fā)展中的作用迄今尚未見報道。
　　實驗目的:
　　擬在先前研究的基礎上，研究FoxA1在大腸癌組織中的表達情況，并通過基因表達

6、譜芯片技術分析大腸癌細胞中FoxA1沉默后基因表達譜的變化，為研究FoxA1在大腸癌浸潤轉移中的作用機制和尋找新的生物學標記及靶向治療藥物提供基礎。
　　實驗方法:
　　1.免疫組化二步法分析31例大腸癌臨床樣本中FoxA1的表達分布。
　　2.通過將大腸癌細胞系SW620感染重組慢病毒的方法敲除FoxA1，并用有限稀釋克隆法建立穩(wěn)定沉默細胞系;通過瞬時轉染技術在293T細胞中過表達FoxA1。
　　3.用Wes

7、tern Blot的方法分別對比FoxA1沉默SW620細胞和正常表達的SW620細胞中EMT相關基因的表達和FoxA1過表達的293T細胞和正常293T細胞EMT相關基因的表達。
　　4.提取FoxA1沉默的SW620細胞和正常表達的SW620細胞的mRNA逆轉錄成eDNA后做基因表達譜芯片分析。
　　5.基因芯片的結果用DAVID軟件和atBIONET軟件進行GO分析、pathway分析和網(wǎng)絡分析。
　　實驗結果:

8、
　　1.FoxA1在31例大腸癌組織樣本中都呈強陽性表達，其表達主要位于大腸癌上皮細胞內(nèi)，間質細胞不表達FoxA1。其中部分大腸癌上皮細胞內(nèi)FoxA1表達降低或缺失，可能與發(fā)生EMT有關。
　　2.用Western blot的方法發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞SW620細胞中FoxA1沉默后上皮表型標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達下調，間質表型標志波形蛋白(Vimentin)表達上調;293T細胞中過表達FoxA1后，EMT

9、誘導轉錄因子Slug和Snail表達水平均下降，提示FoxA1沉默可以誘導EMT發(fā)生。
　　3.經(jīng)Human Genome U133 Plus2.0 Array基因表達譜芯片分析，F(xiàn)oxA1沉默組和對照組之間有1469個差異表達基因，其中666個基因FoxA1沉默后表達上調，803個基因表達下調。其中間質同源框蛋白2基因(MEOX2)相對上升了67.76倍，神經(jīng)源性絲氨酸蛋白酶抑制劑基因（SERPINI1）上升了33.05倍，核糖

10、體蛋白S6基因（RPS6）下降了98.04倍，細胞因子樣蛋白1基因(CYTL1)下降了77.13倍，白細胞活化粘附分子基因(ALCAM)下降了57.10倍。
　　4.GO分析提示差異表達的基因的功能分類主要集中在細胞粘附、發(fā)育和結合等方面;Pathway分析顯示差異基因參與的信號通路主要有腫瘤相關信號通路，黏著斑信號通路，胰島素信號通路等;網(wǎng)絡分析預測了差異表達基因中的潛在的分子標志物。
　　結論:
　　1.部分大腸癌