Ⅰ組代謝型谷氨酸受體(mGluR1-5)在縫隙連接蛋白43(Cx43)參與的室性心律失常中的作用和分子機(jī)制.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
 ?、窠M代謝型谷氨酸受體(mGluR1/5)和交感神經(jīng)的活性密切相關(guān),同時(shí)交感神經(jīng)在大鼠心臟中發(fā)揮著調(diào)節(jié)縫隙連接蛋白43(Cx43)磷酸化和分布的作用。所以mGluR1/5通過(guò)間接地調(diào)節(jié)Cx43發(fā)揮調(diào)節(jié)縫隙連接細(xì)胞間交流中(GJIC)的作用。另外,研究已經(jīng)證實(shí)mGluR1/5在心室肌細(xì)胞閏盤上有表達(dá),閏盤是由Cx43所組成,mGluR1/5和Cx43同在心室肌細(xì)胞的潤(rùn)盤上表達(dá),除此之外,PKC和MAPK都是參與mGluR1

2、/5介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和Cx43磷酸化的重要分子。因此,我們提出假設(shè):mGluR1/5是否可以不通過(guò)交感神經(jīng)介導(dǎo)直接調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化和GJIC的抑制。Ⅰ組mGluRs可能通過(guò)活化PKC和MAPK參與到了Cx43的磷酸化,進(jìn)一步調(diào)節(jié)GJIC。在此實(shí)驗(yàn)中,我們研究了Ⅰ組mGluRs是如何在調(diào)節(jié)Cx43磷酸化和GJIC中發(fā)揮作用的,并探討了可能的機(jī)制。
  目的:
  1.探索Ⅰ組代謝型谷氨酸受體(mGluR1/5)與縫隙連接

3、道白43(Cx43)的磷酸化和縫隙連接細(xì)胞間交流中(GJIC)的關(guān)系;
  2.探索mGluR1/5通過(guò)何種分子機(jī)制在Cx43的磷酸化和GJIC發(fā)揮作用。
  方法:
  1.用Western-blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)mGluR1/5存在于H9c2心肌成纖維細(xì)胞;
  2.將H9c2心肌成纖維細(xì)胞用不同濃度的mGluR1/5激動(dòng)劑DHPG進(jìn)行處理(終濃度為0.1、1、10、100、1000μM),再進(jìn)行不同的時(shí)

4、間段處理(作用時(shí)間為5、10、15、30、60、120min),Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cx43的磷酸化狀態(tài),最終確定最佳的作用時(shí)間和作用濃度;
  3.分別用mGluR1和mGluR5的阻滯劑對(duì)心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),Western-blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Cx43磷酸化蛋白的檢測(cè);
  4.用MEK1阻滯劑干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞,用Western-blot檢測(cè)Cx43和ERK1/2的磷酸化狀態(tài);
  5.用蛋白激酶C(

5、PKC)的阻滯劑處理H9c2心肌成纖維細(xì)胞。用Western-blot進(jìn)行Cx43和ERK1/2的磷酸化狀態(tài)的檢測(cè);
  6.用染料劃痕示蹤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞在不同干預(yù)狀態(tài)下縫隙連接細(xì)胞間的分子傳遞情況。
  結(jié)果:
  1.證實(shí)了mGluR1/5在H9c2心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)
  研究發(fā)現(xiàn)在H9c2心肌成纖維細(xì)胞中有mGluR1和mGluR5的發(fā)現(xiàn),且mGluR1的蛋白表達(dá)量更高;
  2.mGlu

6、R1/5的激動(dòng)劑DHPG對(duì)Cx43蛋白磷酸化水平和總量以及GJIC的影響
  mGluR1/5激動(dòng)劑DHPG的應(yīng)用誘發(fā)了Cx43的高度磷酸化(Cx43的磷酸化(P2)含量增加,而去磷酸化的Cx43(P0)和低度磷酸化Cx43(P1)的含量是降低的),同時(shí)總的Cx43蛋白的含量是下降的。隨著Cx43的高度磷酸化量增加,GJIC的抑制更加明顯。DHPG的最佳反應(yīng)時(shí)間和濃度分別為15min和100μM;
  3.mGluR1/5的

7、阻滯劑對(duì)DHPG誘導(dǎo)的Cx43磷酸化和GJIC抑制的作用
  mGluR1的阻滯劑LY367385和mGluR5的阻滯劑MPEP用于可以檢測(cè)具體是哪一種受體參與到了DHPG的作用,LY367385取消了DHPG誘發(fā)的Cx43磷酸化和GJIC的抑制,而MPEP并沒(méi)有發(fā)揮此作用,Cx43的磷酸化和GJIC得抑制主要通過(guò)mGluR1發(fā)揮作用;
  4.PKC的抑制劑對(duì)DHPG誘導(dǎo)Cx43和ERK1/2磷酸化和抑制GJIC的作用

8、r>  PKC抑制劑沒(méi)有取消DHPG誘導(dǎo)的Cx43的磷酸化和GJIC的抑制,同時(shí)DHPG誘發(fā)的ERK1/2的磷酸化也不受PKC抑制劑的影響;
  5.MEK1的抑制劑對(duì)DHPG誘導(dǎo)Cx43和ERK1/2磷酸化和抑制GJIC的作用
  MEK1的抑制劑取消了DHPG誘導(dǎo)的Cx43的磷酸化和GJIC的抑制,這表明ERK1/2參與到了mGluR1/5介導(dǎo)的Cx43的磷酸化和GJIC的抑制。
  結(jié)論:
  1.在H9c

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