Ⅰ組代謝型谷氨酸受體(mGluR1-5)在縫隙連接蛋白43(Cx43)參與的室性心律失常中的作用和分子機制.pdf

1、背景：
　?、窠M代謝型谷氨酸受體(mGluR1/5)和交感神經的活性密切相關，同時交感神經在大鼠心臟中發(fā)揮著調節(jié)縫隙連接蛋白43(Cx43)磷酸化和分布的作用。所以mGluR1/5通過間接地調節(jié)Cx43發(fā)揮調節(jié)縫隙連接細胞間交流中(GJIC)的作用。另外，研究已經證實mGluR1/5在心室肌細胞閏盤上有表達，閏盤是由Cx43所組成，mGluR1/5和Cx43同在心室肌細胞的潤盤上表達，除此之外，PKC和MAPK都是參與mGluR1

2、/5介導的信號級聯(lián)反應和Cx43磷酸化的重要分子。因此，我們提出假設:mGluR1/5是否可以不通過交感神經介導直接調節(jié)Cx43的磷酸化和GJIC的抑制。Ⅰ組mGluRs可能通過活化PKC和MAPK參與到了Cx43的磷酸化，進一步調節(jié)GJIC。在此實驗中，我們研究了Ⅰ組mGluRs是如何在調節(jié)Cx43磷酸化和GJIC中發(fā)揮作用的，并探討了可能的機制。
　　目的：
　　1.探索Ⅰ組代謝型谷氨酸受體(mGluR1/5)與縫隙連接

3、道白43(Cx43)的磷酸化和縫隙連接細胞間交流中(GJIC)的關系;
　　2.探索mGluR1/5通過何種分子機制在Cx43的磷酸化和GJIC發(fā)揮作用。
　　方法：
　　1.用Western-blot和免疫熒光技術檢測mGluR1/5存在于H9c2心肌成纖維細胞;
　　2.將H9c2心肌成纖維細胞用不同濃度的mGluR1/5激動劑DHPG進行處理（終濃度為0.1、1、10、100、1000μM)，再進行不同的時

4、間段處理(作用時間為5、10、15、30、60、120min)，Western-blot實驗檢測Cx43的磷酸化狀態(tài)，最終確定最佳的作用時間和作用濃度;
　　3.分別用mGluR1和mGluR5的阻滯劑對心肌成纖維細胞進行干預，Western-blot實驗進行Cx43磷酸化蛋白的檢測;
　　4.用MEK1阻滯劑干預心肌成纖維細胞，用Western-blot檢測Cx43和ERK1/2的磷酸化狀態(tài);
　　5.用蛋白激酶C(

5、PKC)的阻滯劑處理H9c2心肌成纖維細胞。用Western-blot進行Cx43和ERK1/2的磷酸化狀態(tài)的檢測;
　　6.用染料劃痕示蹤實驗檢測心肌成纖維細胞在不同干預狀態(tài)下縫隙連接細胞間的分子傳遞情況。
　　結果：
　　1.證實了mGluR1/5在H9c2心肌成纖維細胞進行表達
　　研究發(fā)現(xiàn)在H9c2心肌成纖維細胞中有mGluR1和mGluR5的發(fā)現(xiàn)，且mGluR1的蛋白表達量更高;
　　2.mGlu

6、R1/5的激動劑DHPG對Cx43蛋白磷酸化水平和總量以及GJIC的影響
　　mGluR1/5激動劑DHPG的應用誘發(fā)了Cx43的高度磷酸化(Cx43的磷酸化(P2)含量增加，而去磷酸化的Cx43(P0)和低度磷酸化Cx43(P1)的含量是降低的），同時總的Cx43蛋白的含量是下降的。隨著Cx43的高度磷酸化量增加，GJIC的抑制更加明顯。DHPG的最佳反應時間和濃度分別為15min和100μM;
　　3.mGluR1/5的

7、阻滯劑對DHPG誘導的Cx43磷酸化和GJIC抑制的作用
　　mGluR1的阻滯劑LY367385和mGluR5的阻滯劑MPEP用于可以檢測具體是哪一種受體參與到了DHPG的作用，LY367385取消了DHPG誘發(fā)的Cx43磷酸化和GJIC的抑制，而MPEP并沒有發(fā)揮此作用，Cx43的磷酸化和GJIC得抑制主要通過mGluR1發(fā)揮作用;
　　4.PKC的抑制劑對DHPG誘導Cx43和ERK1/2磷酸化和抑制GJIC的作用

8、r>　　PKC抑制劑沒有取消DHPG誘導的Cx43的磷酸化和GJIC的抑制，同時DHPG誘發(fā)的ERK1/2的磷酸化也不受PKC抑制劑的影響;
　　5.MEK1的抑制劑對DHPG誘導Cx43和ERK1/2磷酸化和抑制GJIC的作用
　　MEK1的抑制劑取消了DHPG誘導的Cx43的磷酸化和GJIC的抑制，這表明ERK1/2參與到了mGluR1/5介導的Cx43的磷酸化和GJIC的抑制。
　　結論：
　　1.在H9c