內(nèi)皮祖細(xì)胞移植延緩進(jìn)展性局灶節(jié)段性腎小球硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬采用文獻(xiàn)報(bào)道的改良阿霉素腎病誘導(dǎo)的FSGS模型，即單側(cè)腎切除后分次注射阿霉素，如果不給予其他干預(yù)措施，動(dòng)物將在腎切除和注射阿霉素后12-16周發(fā)展為FSGS。在本實(shí)驗(yàn)中阿霉素第二次注射后1周，即FSGS的進(jìn)展過程中，將體外培養(yǎng)的EPCs移植，依賴EPCs的“歸巢”特性使EPCs向受損的大鼠腎臟歸巢，觀察其對(duì)FSGS的進(jìn)展是否有延緩作用。由于VEGF的半衰期僅30-40分鐘，直接補(bǔ)充VEGF的作用時(shí)間非常短暫，而且全身使用有諸多問

2、題包括增加腫瘤風(fēng)險(xiǎn)、濃度不能維持以及價(jià)格昂貴等，因而將VEGF165重組腺病毒在體外構(gòu)建并轉(zhuǎn)染培養(yǎng)獲得的EPCs再移植給阿霉素誘導(dǎo)的進(jìn)展期FSGS大鼠，EPCs在體內(nèi)修復(fù)足細(xì)胞等細(xì)胞損傷的同時(shí)，持續(xù)合成分泌VEGF165，觀察轉(zhuǎn)染VEGF165的EPCs對(duì)FSGS進(jìn)展是否比單用EPCs有更好的延緩作用，探討‘EPCs移植和VEGFl65轉(zhuǎn)染：EPCs移植在’FSGS進(jìn)展中的作用和可能機(jī)制，為臨床采用EPCs移植和VEGF轉(zhuǎn)染EPCs移植

3、治療FSGS的設(shè)想提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果： 1.大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 采用密度梯度離心法從雄性SD大鼠骨髓中得到單個(gè)核細(xì)胞，在特定的條件下進(jìn)行分離純化，通過貼壁法培養(yǎng)、體外擴(kuò)增獲取貼壁細(xì)胞，采用流式細(xì)胞表型檢測(cè)、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫雙熒光等方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果證實(shí)，通過此方法獲得的細(xì)胞即是EPCs，為EPCs移植作好了準(zhǔn)備。采用雄性大鼠EPCs的目的是將雄性大鼠特有的Y染色體

4、作為外源性EPCs的標(biāo)記。 2.腺病毒介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ+HindⅢ從質(zhì)粒載體中切出VEGF165基因片段，與KpnⅠ +HindⅢ雙酶切的pAdTrack-CMV形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-VEGF165，PmeⅠ酶切線性化后與腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，并在293細(xì)胞中包裝成Ad-VEGF165，PCR和West

5、ernBlot法鑒定目的蛋白表達(dá)。貼壁法體外培養(yǎng)獲得大鼠骨髓來源的EPCs(同前)，Ad-VEGF165體外轉(zhuǎn)染EPCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后目的基因蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果顯示：利用CsC12法由pAdqTrack-VEGF165和pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，可獲得陽性重組體細(xì)菌克隆。PCR和WesternBlot以及基因測(cè)序分析進(jìn)行鑒定，表明重組腺病毒已含有目的基因，并能夠高效表達(dá)目的蛋白，序列正確；病毒滴度為1.4×1

6、010pfu/ml。Ad-VEGF165基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)第6d的EPCs后24h開始培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達(dá)顯著增加。證實(shí)體外構(gòu)建VEGF165重組腺病毒成功并且可以成功轉(zhuǎn)染EPCs，EPCs合成和分泌VEGF顯著增加，為VEGF165轉(zhuǎn)染EPCs移植到動(dòng)物的在體實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。 3.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植或VEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)進(jìn)展性FSGS的進(jìn)展的影響 雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(對(duì)照組)、阿霉素腎病組(腎

7、病組)、EPC移植組(EPC組)和VEGF轉(zhuǎn)染EPCs后移植組(VEGF組)。腎病組、EPC組和VEGF組行單腎切除，術(shù)后1w和2w分別尾靜脈注射阿霉素制作阿霉素誘導(dǎo)的FSGS，對(duì)照組假手術(shù)并在相同時(shí)間點(diǎn)注射生理鹽水。于第二次注射阿霉素后1w，5Gy的X線全身照射后，EPC組尾靜脈注射移植1×106的EPCs，VEGF組尾靜脈注射移植1×106轉(zhuǎn)染了VEGF165重組腺病毒的EPCs，對(duì)照組和腎病組僅行同等劑量的X線照射和生理鹽水注射。

8、在切腎前(0w)和切腎后的第4(即EPCs移植后1w)、8、12、16w測(cè)大鼠體重、尿蛋白，處死大鼠取血測(cè)血清肌酐(SCr)、白蛋白(ALB)，原位雜交法觀察腎組織中Y染色體陽性細(xì)胞摻入情況，以證實(shí)雄性供鼠來源的EPCs到達(dá)并整合入雌性受鼠的腎組織中；觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)和組織學(xué)變化，圖像分析計(jì)算腎小球硬化指數(shù)、腎小球毛細(xì)血管袢管腔開放程度及毛細(xì)血管袢截面積，同時(shí)免疫組化和WesternBlot檢測(cè)腎組織中VEGF的表達(dá)，并檢測(cè)與細(xì)胞外基質(zhì)

9、(Extracellularmatrix，ECM)代謝關(guān)系非常密切的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)和多種腎臟固有細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)在腎組織中的表達(dá)，作為各組腎組織慢性化轉(zhuǎn)化程度的指標(biāo)。 結(jié)果顯示：(1)原位雜交的結(jié)果證實(shí)雄性大鼠來源的EPCs到達(dá)并整合到雌性阿霉素腎病大鼠的腎臟組織中，

10、而且這種整合從移植后1w直到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，但有逐漸減弱趨勢(shì)。整合的部位位于腎小球內(nèi)和腎小管上皮細(xì)胞。(2)腎病組大鼠的一般情況最差，次第為EPC組、VEGF組，對(duì)照組一般情況較好，一般情況包括大鼠精神、進(jìn)食和體重。(3)實(shí)驗(yàn)室檢查：EPC組和VEGF組從第4w開始尿蛋白即顯著低于腎病組，在第8w和第12wVEGF組尿蛋白顯著低于EPC組(p＜0.05)；SCr測(cè)定顯示，EPC組從第8w開始SCr顯著低于腎病組，VEGF組SCr從第4w開始顯

11、著低于腎病組，至第16w時(shí)有所增高，但顯著低于腎病組和EPC組；ALB結(jié)果顯示，EPC組的ALB從第4w開始下降，各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組，但第12、16w時(shí)顯著高于腎病組；VEGF組的結(jié)果與EPC組的結(jié)果相似，但在12w和16w，VEGF組ALB顯著高于EPC組(p＜0.05)。這些結(jié)果提示EPCs移植參與了EPC組和VEGF組尿蛋白下降、腎功能異常出現(xiàn)時(shí)間的延后以及血清ALB提高。(4)腎臟組織學(xué)和圖像分析的結(jié)果顯示，第16w時(shí)EP

12、C組和VEGF組腎小球毛細(xì)血管管腔開放程度顯著高于腎病組，且VEGF組顯著高于EPC組，VEGF組的毛細(xì)血管腔開放最好；毛細(xì)血管袢截面積的結(jié)果與。腎小球毛細(xì)血管腔開放程度的結(jié)果相似，系膜基質(zhì)相對(duì)含量也顯示EPC組和VEGF組較腎病組顯著降低，VEGF組又顯著低于EPC組；腎病組腎小球硬化指數(shù)顯著高于EPC組和VEGF組，而VEGF組的腎小球硬化指數(shù)最低。(5)透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示：EPC組和VEGF組腎小球足細(xì)胞損傷修復(fù)

13、和腎小管上皮細(xì)胞損傷的減輕均早于腎病組，而VEGF組修復(fù)出現(xiàn)的時(shí)間更早。(6)免疫組化染色和WesternBlot分析顯示：EPC組和VEGF組的腎組織VEGF表達(dá)較對(duì)照組和腎病組明顯增強(qiáng)，直到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)；VEGF組腎組織的VEGF表達(dá)較EPC組更強(qiáng)，VEGF蛋白表達(dá)也證實(shí)此結(jié)果；腎病組、EPC組和VEGF組腎組織TGF-β1、α-SMA的表達(dá)均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，但EPC組和VEGF組較同時(shí)間點(diǎn)的腎病組明顯減弱，而VEGF組的表達(dá)

14、最弱；其蛋白表達(dá)也證實(shí)此結(jié)果。 結(jié)論： 1.采用密度梯度離心法收集骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下通過貼壁培養(yǎng)可以獲取足夠數(shù)量的EPCs，在短時(shí)間內(nèi)可在體外擴(kuò)增，并最終在體外分化為有功能的具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞。 2.采用DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了Ad-VEGF165重組腺病毒，且Ad-VEGF165能高效、穩(wěn)定地表達(dá)VEGF165目的基因且具有良好的安全性；構(gòu)建的Ad-VEGF165能夠