可視化檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP法的建立及其對(duì)流行狀況的初步調(diào)查.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)，又稱“紅鼻病”和“壞死性鼻炎”。由牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus1，BoHV-1)—牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV)，引發(fā)牛的一種急性、熱性、接觸性疫病，主要引起病牛發(fā)熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥等，是導(dǎo)致牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的一個(gè)主

2、要原因。目前，我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)正向規(guī)?；?、集約化迅速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外活畜和遺傳物質(zhì)貿(mào)易日益頻繁，這給IBR的流行與傳播創(chuàng)造了良好條件。而且我國(guó)還沒(méi)有市場(chǎng)化疫苗，也未實(shí)施監(jiān)測(cè)和控制計(jì)劃。目前已知絕大多數(shù)流行病學(xué)報(bào)道都是檢測(cè)血清IBRV抗體，現(xiàn)有資料表明該病在我國(guó)已呈現(xiàn)高度蔓延趨勢(shì)，我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)已遭受極大損失，因此研究該病病原檢測(cè)技術(shù)和方法，加強(qiáng)病原控制有著非常重要的意義。
　　目前，我國(guó)基層牛場(chǎng)由于實(shí)驗(yàn)室的條件限制，調(diào)查該病病原的流行情況往往不

3、能及時(shí)進(jìn)行。本研究旨在建立針對(duì)病原IBRV的簡(jiǎn)便快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，利用該方法能夠?qū)Σ≡餍袪顩r做現(xiàn)場(chǎng)分析。本研究?jī)?nèi)容由兩個(gè)部分組成:
　　第一部分:基于顏色判斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)快速檢測(cè)IBRV研究
　　為創(chuàng)建一種檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的LAMP可視化方法，根據(jù)已發(fā)表的IBRV gB基因序列，設(shè)計(jì)合成了3對(duì)擴(kuò)增IBRV gB

4、基因靶序列的特異性引物，并優(yōu)化了LAMP反應(yīng)溶液組分，成功創(chuàng)建了IBRV的LAMP可視化檢測(cè)法，驗(yàn)證了其敏感性、特異性以及對(duì)臨床樣品的檢測(cè)情況。結(jié)果表明，該法可在50min內(nèi)檢測(cè)出10copies的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，且不發(fā)生交叉反應(yīng)，通過(guò)肉眼直接觀察即可判斷結(jié)果。檢測(cè)臨床樣品發(fā)現(xiàn)，被檢奶牛場(chǎng)IBRV感染嚴(yán)重:鼻拭子樣品中IBRV的陽(yáng)性率介于79.4％-95.7％，總陽(yáng)性率為84.4％;血清樣品中IBRV的陽(yáng)性率介于48.2％-69.4％，總

5、陽(yáng)性率為56.5％。該方法的建立為基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)IBRV提供了便利，也為快速檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:牛傳染性鼻氣管炎的流行病學(xué)調(diào)查
　　為了驗(yàn)證上海市崇明島奶牛場(chǎng)IBR的流行情況和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析，采用套式PCR方法分別對(duì)兩個(gè)奶牛場(chǎng)的鼻拭子樣品及血清樣品進(jìn)行IBR病原檢測(cè)。結(jié)果顯示，鼻拭子樣品中IBRV的陽(yáng)性率介于77.5％-96.7％，總陽(yáng)性率為83.4％;血清樣品中IBRV的陽(yáng)性率介于50.0％-5

6、2.8％，總陽(yáng)性率為51.1％。與LAMP法檢測(cè)的結(jié)果相比發(fā)現(xiàn)，兩檢測(cè)方法符合率高（總符合率為92.4％）;卡方檢驗(yàn)（McNemar檢驗(yàn)）表明，兩法對(duì)樣品中IBRV的檢出率差異不顯著，證明了LAMP檢測(cè)法的可靠性。病原學(xué)分析表明:本研究所擴(kuò)得序列BHV-1/SH309與巴西毒株IBR6813(DQ006851),BH81(DQ006854), LD30/2(DQ006855), LD15(AY758382)以及AY330349的同源性在